ES 细胞培养攻略

勒夫

ES 细胞培养  Q' [) a3 S  c6 r* x
原代胚胎成纤维细胞（ME）的制备
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' ]* l" ]6 r% D3 S: J1. 取12.5-13.5dpc孕鼠，断颈处死；
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' L' I& w4 A# w! h& A2. 将鼠腹面向上放置，70% 酒精润湿、消毒腹部（防止腹毛飞扬，污染内脏及子宫），剪开皮肤层、肌肉层，打开腹腔，将连接在子宫上的结缔组织及脂肪剪去，将子宫取出，转入无菌10cm平皿中；
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0 c0 c; |  r1 {3. 把平皿转入超净台；
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4. 用镊子打开子宫壁，挤出鼠胚，并与胚外组织、胎盘等分离，除去鼠胚的头、四肢及各种内脏（主要为肝脏、肺脏、心脏和肠胃等）；
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5. 将鼠胚移入另一新的无菌皿，用PBS洗三次；
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1 V# r5 f: i6 g: H; y" q0 G6. 弃去PBS，用弯头剪将鼠胚剪碎，加入PBS洗至溶液基本无色（1－4次）；: I2 h. g3 A% r4 D- e) A

' c: K+ i' O5 I( u; A- B7. 加入适量Trypsin-EDTA（0.25% Gibco 25520，下同），体积约等于组织块体积；
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9 Y+ a& }0 d. S1 u6 W  q& x2 v8. 用滴管轻轻吹匀，室温下消化1－10分钟（或消化至溶液浑浊变粘），加入与消化液等体积培养基，轻轻吹打混匀（5－10次），静置；
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9. 沉降后将上部溶液轻轻吸出，转入离心管中。( f- v- Q; s$ A+ I
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10. 将细胞悬液管离心（1000转5分钟）；/ Z% m% D4 U& J1 i3 H

/ `6 D4 L( W0 m3 E5 @9 n& x9 W11. 弃去上清，向沉淀中加入适量培养基，轻轻吹打重悬，将其分种至10 cm细胞培养皿，补加适量培养基，作标签（ME－0；注意：若冻存，则可以使用复苏后的0代ME制作Feeder；若直接使用则最好不用0代ME细胞做Feeder，要传到一代以后再用来制作Feeder比较好），转入培养箱培养；
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12. 视细胞生长情况换液（一般3天换液一次），若细胞已长满，则冻存，或者1：3-5传代（视细胞疏密而定），放入培养箱继续培养（此后不用再换液）；1－5代的ME细胞均可用来制作Feeder。
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饲养层细胞（Feeder）的制备0 l! ?! W) t% E/ W0 m
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注：含10 ug/ml丝裂霉素C的DMEM血清培养基（FBS占10%）（实验室所用MMC为10 mg/mL，Calbiochem）
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7 Q6 Z$ l! r! A: e, T1.弃去细胞培养皿中的培养液，加入适量含10ug/ml丝裂霉素C的培养基（DMEM+10% FBS）；. y- {# Y% @( ]  V4 [) E

# o: N9 h8 Q8 i3 ?3 m9 ?3 [2. 放入培养箱培养3小时（2－4小时）；
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6 p; L, L5 ?" I! x% K3 @# `7 j3. 用0.1% 明胶处理培养皿（将明胶加入，摇动使明胶覆盖全部皿底，然后吸出明胶弃去即可），室温放置2小时以上，至皿底明胶干燥为止；
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4. 弃去含有丝裂霉素C的培养基，加入2－3 mL PBS，轻轻摇动，弃去PBS，如此洗3-5次（必须洗3次以上，以便彻底洗去残存的丝裂霉素，丝裂霉素是有丝分裂抑制剂，因而对ES细胞有毒性）；! v2 W. V. r- u5 [. ]9 p3 y! ?
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5. 加入适量胰酶消化30秒，吸去消化液，静置至细胞层出现裂缝或明显滑壁为止，加入培养基，吹打，种至明胶处理过的培养皿中即可（如细胞过稀，可再补加丝裂霉素处理过的细胞），半小时后即可使用（如果急用，则可以用ES细胞培养基终止消化，然后与ES细胞一起转入明胶处理过的新板上），可使用6－10天，用前更换培养液（如未用明胶处理培养皿，则需在培养箱中放置2小时以上方可使用；最好是前一天下午制作Feeder，第二天上午使用，这时的Feeder状态最好，最适于ES细胞贴壁生长，而且万一制作的Feeder在第二天早上发现出了问题，还可以赶紧补做）。5 O9 |$ N. N6 W, a+ o
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ES细胞培养基1 u, H7 T2 _, }' i& O) s5 N+ M5 a

2 m# I+ S* Q/ |" A: bDMEM+15%FBS
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2 k+ L7 ?7 d! \/ e0 }" Q% n4 \2-巯基乙醇：5.5uM        
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0 E! f$ R' {/ J% v9 q! ?) O8 x1 YL-谷氨酰胺：2mM        . n3 G8 q, z0 P

- z  T6 m  W" ]' _! BLIF：1000U/mL                         10000X        
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- [1 }: A4 w/ Q7 M( q, w非必需氨基酸：100uM                100X         
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双抗：                                        100X        6 L5 f9 N: _/ a. _

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ES细胞的复苏
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1. 提前制备好相应数量的Feeder；
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2 m* z4 F5 T0 Y' r1 ^7 g2. 准备37－39℃的热水，从液氮罐中取出所需冻存管（冻存细胞），迅速投入热水中，迅速剧烈摇动直至冻存液全部融化；( k% [1 H& q: E6 W

( Z( K: A2 _# n$ {- n3. 转入无菌间，1000转/分钟离心5-10分钟；
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4. 弃上清，加入1 ml ES培养液轻轻吹打重悬，转入铺有饲养层细胞的培养皿中（冻存前细胞来自多大的培养皿，复苏时就用相应大小的培养皿），补加适量培养液；
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5. 转入培养箱培养，次日换液；此后每24小时换一次液，每48小时传一次代（视生长情况）。5 U! ?! T2 D, b4 _; _" D) f
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ES细胞的换液1 A% \" a. D' v
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1. 提前半小时左右将培养基从4℃冰箱取出，放于室温（或者放于37℃温箱内）；. F2 [: w2 \- a

- s4 L' _4 P( A7 d* S, {1 `" `2. 细胞培养皿从培养箱内取出，相差显微镜下作常规观察（判断生长情况，并确证未发生污染）后转入无菌操作台内；
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7 l9 P/ `8 h$ z, D  c" @: j6 i3. 将ES细胞培养皿内的液体吸出、弃去，换新鲜培养基（6 cm培养皿约5 mL，3.5 cm培养皿约3 mL培养基；若死细胞较多则可以先用PBS洗一次，再加培养基）；9 A! j9 d3 e2 L2 c
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4. 放回培养箱继续培养。# T" ~  S8 E- v

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ES细胞的传代
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1. 前一天下午做好所需数量的Feeder细胞板；
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2. 提前半小时左右将培养基从4℃冰箱取出，放于室温（或者放于37℃温箱内）；
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3. 将ES细胞培养皿、Feeder细胞培养皿从培养箱内取出（相差显微镜下作常规观察，Feeder细胞应生长良好，细胞覆盖95%左右，至少90%以上的培养皿面积）；ES细胞应生长良好，接近长满培养皿，细胞集落大小一致、疏密均匀，集落形状规则、呈椭圆形、边缘光滑、表面光滑，细胞生长致密、核大、胞质少；
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- @1 O. j5 ?6 S2 H- j' b5 z4. 将ES细胞培养皿内的液体吸出、弃去，用PBS 1 mL左右洗一遍，加入胰蛋白酶溶液，作用约30秒，小心吸出胰蛋白酶溶液，弃去；再作用1—5分钟，不时观察，待细胞层（皿底一层白色脏东西样膜）出现裂缝并明显开始下滑时，补加培养基，适度吹打（视消化程度及管口粗细而定，至看不到明显的大的细胞团块为止）；平均分到Feeder培养皿中（滴加，以免将Feeder细胞吹脱落下来），滴加补加培养基至5 ml左右（滴加，以免将Feeder细胞吹脱落下来；若为3.5cm培养皿，则补加至3ml左右），作好标签；
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5. 前后左右水平晃动培养皿，使ES细胞均匀分布于培养皿中，放入培养箱继续培养。# N) m9 @0 U8 M# X7 X! v+ A# v6 X1 D+ M
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ES细胞的冻存( h# g4 W0 D) [0 a, |; O6 r8 }

# p4 b" Z7 D/ L, R) g1 X1. 常规方法将细胞消化成单细胞悬液；# \! G7 S8 k2 p$ {
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2. 转入试管，1000转/分钟离心5分钟； $ [/ B8 N3 `/ i4 N  C# [
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3. 配适量冻存液（为含10% 二甲亚砜（DMSO），10% FBS的DMEM培养液）；% n3 Q& m9 w* |# q0 e+ N

; ~& d! s- g5 ~: W6 d4. 弃上清，每管加入1ml冻存液，吹打成细胞悬液（只要使ES细胞分散成3—5个细胞的小团块即可），转入冻存管，作好标签；
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+ [4 g  @- ^: M+ L5. 放入程序冻存盒内24小时后转入液氮罐中冻存。