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本帖最后由 细胞海洋 于 2015-12-22 12:26 编辑 1 X/ w6 W8 ?; y9 i2 y/ v$ g9 m$ d
3 m4 o% e0 ^1 g6 H1 D有一个相关的，希望对你有帮助
, G% S0 E7 X2 q一、目的; G3 j. u" L5 `# J, X
$ c7 J) S. w" Y% _5 a8 `8 T2 k' O
MDCK细胞培养是分离流感病毒及相关研究实验的基本技术。疾控中心的所有技术人员，必须按照本文件相关的操作规程进行操作。) N \+ h' X* ~& t u8 v2 J
7 N9 X3 ?1 |5 l; L2 r: x* S. L9 M二、适用范围0 G* p1 V$ w; B3 `+ S/ \: r Q
1 F8 k. a# w- K. [适用于疾控中心所有技术人员 。
, J; Y# f9 @/ m
* f: E% e6 ~5 c" F9 P0 }# W% Z三、程序
4 b/ t2 Z* e" F+ H' H2 ~3 d# y
8 v! U! U- b, H- w（一）生物安全要求
& ^% b! A# f9 x) j& I4 @) G# R* s
n0 _2 `4 m7 K* s; H- ?, N实验室生物安全级别：BSL-1
2 h8 T, Z" @: J J: f4 m2 R
# v$ p. R% E% Q+ ]所有操作必须在BSL-1实验室的生物安全柜里进行。
3 R( X \* i/ B( h: \1 ?6 I
- G: f" X8 G0 v0 {3 X: D（二）材料
7 v" m2 t1 y6 b |% A2 x! `6 o" ^' d% Y0 D) e
1. 生长成片的MDCK细胞0 A& }4 t6 e9 y7 `
8 p }. M+ a" s. u: \
2. 无菌的T25细胞培养瓶- Q) O2 X2 w, C' L/ _4 b
5 V# I+ w; a4 Z. X5 S0 N1 j* l/ G3. D-MEM培养液（含有L-谷氨酰胺）
/ h O; |$ G7 V5 k. ^) s1 s5 P1 P: @, ~- g, o0 t9 z
4. 青、链霉素母液（10000 U/mL青霉素G；10000µg/mL硫酸链霉素），分装后保存于-20℃" p6 b/ G- ?8 A( t- {7 i/ }! X/ B) b
( r& j V6 m; R7 o5. HEPES缓冲液，1M母液7 h# G* C2 k$ R+ J2 ?
' P/ _: M W5 U6. 胎牛血清
# G# Y$ L$ B3 v! G) a: K+ _# l) Z: g
7. EDTA-胰酶（0.05%胰酶，0.53mM EDTA-4Na），分装后保存于-20℃# N& r& R0 ^8 o0 @% r
$ J7 F D8 j, z& `2 U
8. 7.5%牛血清白蛋白组分V4 k4 p1 r% v: c
6 |# `' g' z! k6 n9. 1mL、10mL无菌移液管6 _- |5 G( q, _& O
; }+ z7 p" ?) }. a+ `: N10. 70％～75％的酒精
* Z& w6 P# { r6 j% W0 p5 N+ T# M0 o7 O1 w2 n
注意事项：经常检查试剂使用的有效期。
1 k, l2 c5 K2 y# B2 I/ u) U, A9 c& r) ~" I" J9 j; A
（三）实验步骤% r1 [. M) o8 m. y, a2 V; Z }& S+ k
( O; S8 D) f& |+ {7 ? u
这里以T75细胞瓶的单层细胞培养为例，叙述MDCK细胞的培养程序。如果细胞瓶的规格有变，MDCK细胞悬液的量必须做相应的调整。+ X/ f% h8 ]* E# b0 c9 C
+ K( D& S& ]1 I1. D-MEM培养液的准备- J% s+ t* O+ ]) r; m! q$ o
( p6 [7 _4 m1 `6 F) x0 O" u6 L+ N500mL D-MEM液中加入：
5 n9 S- I1 |0 X4 }8 R I, g( l
, J0 a8 g* S, o2 d, \7 V4 Q1 ?青、链霉素母液5mL（终浓度达：100U/mL青霉素；100µg/mL链霉素），
# s) C/ `4 J9 [$ z7 U% q8 h2 V. [) S. x. w
HEPES缓冲液12.5mL（终浓度：25mM）。
# M% D& |! e/ W- } |) B
4 M/ q3 {$ o5 Q7 A* I7.5%牛血清白蛋白组分Ⅴ 12.5mL
0 N+ T0 |9 l: b! t1 F; {5 |. N$ u0 Q
7 v& M( S9 P' L; N# Q/ T2. 细胞生长液的准备6 p% g0 O6 [5 j8 j4 S
& Q! Z; @7 Z: ?( r h& b* t I
胎牛血清10mL加到90mL的上述（1）的液体中，使胎牛血清的终浓度为10%。
* a# Q5 K" ?) w+ M6 |2 l4 w& `) D$ V* A9 J* _- l- f& l
3. 首先将细胞培养瓶中的培养液弃去，加入5mL在37℃水浴中预热的EDTA-胰酶。
9 ]9 q2 D$ R! H5 ]+ t) e
" R; ~) ~, ~8 |% V F0 B# J4. 温和地摇动细胞瓶1min，使EDTA-胰酶均匀分布在整个细胞薄层。然后用移液管吸去EDTA胰酶。8 ?0 q* w2 o% L) w- e! C' _
% d$ ]$ h8 F& p5. 重新加入5mL在37℃水浴中预热的EDTA-胰酶重复上述步骤。6 ], M p9 Y3 y) q4 Q. M
. ~$ B5 k. V1 x: a& I. n
6. 加入1mLEDTA-胰酶使其均匀分布在整个细胞薄层，37℃孵育细胞瓶直至细胞从塑料细胞瓶的表面分离（约5～10min）。必要时可以摇动或吹打来分离细胞。然后加入1mL胎牛血清灭活残余的胰酶。
: N5 @' y) U: l4 f# r; R7 c
) l& n: j- t) v8 X7. 加9mL已经配置好的含有L-谷氨酸的D-MEM培养液，轻轻用移动移液管来吹散细胞团。
, {" s% e& X- ~6 A! J
3 s0 ~. D; r' ]% m5 P1 Q4 w( ` x8. 取10mL混合物加到90mL细胞生长液（细胞悬液的浓度大约为每毫升含105细胞）
! m- O# i/ Y. D t" D7 [; e% m) Y6 r8 ?3 G4 w X
9. 每个T25细胞培养瓶加入6mL（6×105/mL）细胞悬液，剩余的细胞悬液可以加到T75细胞瓶用于细胞传代。通常6mL细胞悬液2～3日可生长成片（80％～90％）的单层细胞。5 l+ ?4 }- _9 ~' b; {$ h
6 y" d0 M4 C& B5 `1 e% R10. 于37℃，5%CO2培养箱里培养细胞，每天观察细胞状态，以供进一步实验用。* h8 ]* p. e3 q- ]% _
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发表于 2015-12-17 08:53
