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本帖最后由 细胞海洋 于 2016-1-8 08:29 编辑 : u8 y* c8 Y3 ^; r+ `8 k
' J. x8 D& V7 D! B- V一、开机程序
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1 T& j+ \' q4 `2 Y l 1、检查稳压器电源,打开电源,稳定5分钟./ e* M/ G7 x4 _/ R4 j g
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2、打开储液箱,倒掉废液,并在废液桶中加入400ml漂白水原液.打开压力阀,取出鞘液桶,将鞘液桶加至4/5满（一般可用三蒸水,做分选必须用PBS或FACSFlow）,合上压力阀.确实盖紧桶盖,检查所有管路是否妥善安置.
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% W8 G/ G, M) X2 D 3、将FACSCalibur开关打开,此时仪器功能控制钮的显示应是STANDBY,预热5－10分钟.排出过滤器内的气泡." p+ ~; H6 f1 v8 J
5 X3 j5 Q& _& O! Y 4、如果需要打印,打开打印机电源./ m+ _ p# }3 t; u% o4 ~- K
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5、打开电脑,等待屏幕显示出标准的苹果标志." Z5 \6 Q, M# H1 e! M: f( z
2 x& `2 Q# d3 _2 y- T- R 6、执行仪器PRIME功能一次,以排除Flowcell中的气泡.* u+ o2 i* [: i$ t% D( e
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7、分析样品时,先用FACAFlow或PBS进行HIGHRUN约2分钟.- H% F9 O" c8 o' D
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做过分选后,每次开机后需冲洗管道：向分选装置上装上两个50ml离心管,不接通浓缩系统,摁下右下角白色按钮开始冲洗.待自动停止后接通浓缩装置,同上法冲洗一次.5 G/ l# B% `3 p6 c U/ x8 m$ }( T9 a
5 f' S- r8 V0 S: V1 V( n+ J 二、预设获取模式文件（AcquisitionTemplateFiles）
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# z9 x$ j; D% ] 1、从苹果标志中选择CELLQuest见一个新视窗,可利用此视窗编辑一个获取模式文件.
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6 E. p5 e2 x% @" k 2、选取屏幕左列绘图工具中的Dotplot,绘出一个或多个DotPlots（点图）.从DotPlot对话框中选取Acquisition作为图形资料来源,并确定适当的x轴和y轴参数.8 h% c$ y$ c1 S, l P, w( p
" Z# n8 k) z4 n% C 3、选取屏幕左列绘图工具中的Histogram,同上法可绘出Histogram（直方图）.3 N5 A" v" O2 [% t- P% M7 D
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4、将此视窗命名后储存于FACStationG3BDApplicationsCELLQuestFolderEXP文件夹中,下次进行相同实验时可直接调用.4 j# N! j# e" {5 u
8 `# z H0 T. }: d/ c; s
本计算机中已设定两个模式文件：ACQ和EXP,储存于FACStationG3BDApplicationsCELLQuestEXP文件夹中,ACQ用于细胞DNA检测，EXP用于细胞表面标志分析.
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三、用CELLQuest进行仪器的设定和调整
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3 {& u. {6 W, K2 ?: m6 f 1、从苹果画面中选取CELLQuest,进入CELLQuest后在File指令栏中打开合适的获取模式文件.2 Q: q3 p9 r4 a/ l9 ?! u5 M# F
: T! H3 Y# R0 C+ w' D- a, n 2、从屏幕上方Acquire指令栏中,选取ConnecttoCytometer（快捷键：＋B）进行电脑和仪器的连机.将出现的AcquisitonControl对话框移至合适位置.. p e" I6 o6 Q
& G: n9 [7 ^; f 3、从Cytometer指令栏中,开启Detectors/Amps、Threshold、Compensation、Status等四个对话框,并将它们移至屏幕右方,以便获取数据时随时调整获取条件.也可以用+1,2,3,4获得此四个对话框.
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5 _* d: Q# Y% J5 O. @! R- t 4、在Detectors/Amps对话框中,先为每个参数选择适当的倍增模式（amplifiermode）：线性模式Lin或对数模式Log.一般进行细胞表面抗原分析如分析外周血的淋巴细胞亚群时,FSC和SSC多以线性模式Lin测量,且DDMParam选择FL2,而FL1,FL2与FL3则以对数模式Log测量；分析细胞DNA含量时,FSC,SSC,FL1,FL2,FL3皆以Lin进行测量,且DDMParam选择FL2；分析血小板表型时,FSC,SSC,FL1,FL2,FL3等均以Log进行测量.
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5、放上待检测的样品,将流式细胞仪设定于RUN,流速可在HIGH或LOW上.
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! D7 a* Q' O; j8 S4 d) ` 6、在AcquisitonControl对话框中,选取Acquire,开始获取细胞.在以下的仪器调整过程中随时选取Pause,Restart以观察调整效果.未完全调整好之前不要去掉SETUP前的“?”.5 W0 _, P( m7 T# A. T, m6 l, Y; V
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7、在Detectors/Amps对话框中,调整FSC和SSC探测器中的信号倍增度：PMTvoltages（粗调）与AmpGains（细调）,使样品信号出现在FSC-SSC点图内,且三群细胞合理分布.
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8、在Threshold对话框中选择适当的参数设定Threshold,并调整Threshold的高低,以减少噪音信号（细胞碎片）.一般做细胞表型时用FSC－H而做DNA时用FL2－H.Threshold并不影响检测器对信号的获取,但可改善画面质量.% p G$ ]) s5 ^4 n
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9、从屏幕左列绘图工具中选取Region（区域）,并在靶细胞周围设定区域线,即通常所说的门.圈定合适的细胞群可使仪器调整更为容易.
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& M3 p) U {( e. `: Q" z+ c 10、在Detectors/Amps对话框中,调整荧光检测器（FL1,FL2,FL3,FL4等）的倍增程度.根据所用的荧光阴性对照样品调整细胞群,使之分布在正确的区域内.% T& g6 v, m; V1 m* _ M
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11、在Compensation对话框中,根据所用的调补偿用标准荧光样品调整双色（或多色）荧光染色所需的荧光补偿.比如应该为FL1+FL2-的细胞群却分布在FL1＋FL2＋区域内,则需调大FL2－？％FL1中的“？”,并从FL1-FL2点图中观察新的调整是否恰当
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. b6 Z1 b) A2 V5 E4 ^ 12、在Status对话框中可见：LaserPower:正常值—Run/Ready为14.7mW,Standby为5mW；Lasercurrent:正常值为6Amps左右.
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5 ^! i+ K! ~+ W: r' A f 13、调整好的仪器设定可在InstrumentSettings对话框中储存,下次进行相同实验时可调出使用,届时只需微调即可.
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本计算机中已有三个名叫储存于FACStationG3BDApplicationsCELLQuestFolderIMM-InstrSettings及FACStationG3BDFilesInstrumentSettingsFilesCalibFile和Mast-Cell-Set的参数文件,前二者可用于分析人白细胞,后者用于分析小鼠肥大细胞.
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四、通过预设的获取模式文件进行样品分析
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1、从苹果标志中选择CELLQUEST,新视窗出现后从File指令栏中选择Open,打开预设的获取模式文件.
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/ V1 k. l7 M G6 q1 [/ n8 c 2、从屏幕上方Acquire指令栏中,选取ConnecttoCytometer进行电脑和仪器的连机.将出现的AcquisitonControl对话框移至合适位置.& p' V: f1 P+ p( w5 N
9 e: i7 D0 Y3 y9 X* w* L 3、从Cytometer指令栏中选取InstrumentSettings,在其对话框中选择Open以调出以前存储的相同实验的仪器设定,按Set确定.
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/ E% u- M4 R/ Y/ X% K* r 4、在Acquire指令栏中,选择Acquisition&Storage决定储存的细胞数,参数,信号道数.其中Resolution在做细胞表面标志时选择256,做DNA时选择1024.ParameterSaved…则根据不同的检测对象选择不同的参数.
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* ^8 m. b, }' m; U, G 5、在Acquire指令栏中,选择ParameterDescription,以决定文件存储位置（folder）,文件名称（file）,样品代号以及各种参数的标记（panel）,即安排tube1,2,3…的检测参数.一般本仪器获取的数据按照检测对象的不同分别储存于FACStationG3BDApplicationsCELLQuestIMM和DNA文件夹中.文件根据日期命名.9 k: \ P) g4 Z& n4 ~# p+ W1 M
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6、在Cytometer指令栏中,选择Counters,将此对话框移至合适位置,以便于随时观察events计数.
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$ w$ n* ?, I; T4 k' v 7、将样品试管放至检测区,在AcquireControl对话框中选取Acquire以启动样品分析测定.9 l! ?4 C2 B; U. @
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8、微调仪器设定,待细胞群分布合适后选择AcquireControl对话框中Pause,Abort,去除Setup前的“?”,开始正式获取信号,存储数据.
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% i1 \+ T* C O/ V- F 9、当一定数目的细胞被测定后,获取会自动停止,并会自动存储数据.重复步骤7,继续分析下一个样品,直到所有的样品数据分析完毕.! v) I$ d& ~7 o
+ Y- d+ ]. f. E- _# Y1 |% g 当所有样品分析分析完毕,即换上三蒸水,并将流式细胞仪置于“STANDBY”状态,以保护激光管.
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1 |) B+ q: f( Z( B, M 五、关机程序& a* k5 l! v1 r( {- F9 r
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1、从File中选择Quit,退出软件,选择Don’tSave至苹果屏幕.
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. x7 }) Y' p7 @9 R 2、用4ml1：10稀释的漂白水作样品,将样品置于旁位（vacuumison）,以外管吸去约2ml,在将样品架置于中位（vacuumisoff）,再HIGHRUN5分钟（内管吸去2ml）.
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3、改用三蒸水4ml作样品,同上处理.
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4、按Prime三次.
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y6 u# p' r, S 5、此时仪器自动转为STANDBY状态,换2ml三蒸水.必须在仪器处于“STANDBY”状态10分钟后再依次关掉计算机、打印机、主机、稳压电源,以延长激光管寿命,并确保应用软件的正常运行.
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6、填写使用登记表. A0 b' B; _' f: b4 Y
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发表于 2016-1-8 00:58
