求助流式细胞仪使用步骤及注意事项

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* W3 ], h2 x! c( {5 C$ q求助流式细胞仪使用步骤及注意事项     以及结论分析，视频或者详细步骤的文献均可

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+ q/ Q7 Y. |' K9 V非常感谢    新手必备啊  

小猫狸狸

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6 T  O( p) I! C一、开机程序
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　　1、检查稳压器电源,打开电源,稳定5分钟.* S. V5 }1 X9 C/ M3 Z
　　
5 d9 z- V6 O2 _  ^8 @# D　　2、打开储液箱,倒掉废液,并在废液桶中加入400ml漂白水原液.打开压力阀,取出鞘液桶,将鞘液桶加至4/5满（一般可用三蒸水,做分选必须用PBS或FACSFlow）,合上压力阀.确实盖紧桶盖,检查所有管路是否妥善安置.; t! [7 Z) I' H# B: T+ f
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　　3、将FACSCalibur开关打开,此时仪器功能控制钮的显示应是STANDBY,预热5－10分钟.排出过滤器内的气泡.
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0 B! k  [  {8 X8 B1 n) ~5 n& s# w4 m　　4、如果需要打印,打开打印机电源.
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　　5、打开电脑,等待屏幕显示出标准的苹果标志.  _( f) R2 G0 x
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　　6、执行仪器PRIME功能一次,以排除Flowcell中的气泡.! R! l$ f3 u9 i9 H% \8 {7 o% S4 t
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　　7、分析样品时,先用FACAFlow或PBS进行HIGHRUN约2分钟.% K* l! A. w: F( t! [
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　　做过分选后,每次开机后需冲洗管道：向分选装置上装上两个50ml离心管,不接通浓缩系统,摁下右下角白色按钮开始冲洗.待自动停止后接通浓缩装置,同上法冲洗一次.
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1 u% A0 [% k/ {  u6 \2 u% \2 x* T　　二、预设获取模式文件（AcquisitionTemplateFiles）" A4 y- N% I. |* B
　　
6 Z; g7 I. @+ n3 z　　1、从苹果标志中选择CELLQuest见一个新视窗,可利用此视窗编辑一个获取模式文件.- H: z( c* ?# }& W" {& J/ T0 T
　　
2 w6 q0 l. \& K+ ]% i1 D9 Y　　2、选取屏幕左列绘图工具中的Dotplot,绘出一个或多个DotPlots（点图）.从DotPlot对话框中选取Acquisition作为图形资料来源,并确定适当的x轴和y轴参数.- E+ i1 U0 B' x/ L, l4 G
　　
- g3 D8 E" v% J; {5 B　　3、选取屏幕左列绘图工具中的Histogram,同上法可绘出Histogram（直方图）.
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　　4、将此视窗命名后储存于FACStationG3BDApplicationsCELLQuestFolderEXP文件夹中,下次进行相同实验时可直接调用., t$ G* Q* P; V4 `9 e
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　　本计算机中已设定两个模式文件：ACQ和EXP,储存于FACStationG3BDApplicationsCELLQuestEXP文件夹中,ACQ用于细胞DNA检测，EXP用于细胞表面标志分析.- m  P' t% Y- o) N% e0 t" z+ O
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　　三、用CELLQuest进行仪器的设定和调整/ J) p9 W+ Y6 ]0 n5 ~
　　
6 ~( a( `& b/ k' B　　1、从苹果画面中选取CELLQuest,进入CELLQuest后在File指令栏中打开合适的获取模式文件.9 U% Q1 X2 r/ J2 g0 N
　　
3 o* G) A0 k% F' Y5 e  ~　　2、从屏幕上方Acquire指令栏中,选取ConnecttoCytometer（快捷键：＋B）进行电脑和仪器的连机.将出现的AcquisitonControl对话框移至合适位置.
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$ s% R! F) ?5 |7 L　　3、从Cytometer指令栏中,开启Detectors/Amps、Threshold、Compensation、Status等四个对话框,并将它们移至屏幕右方,以便获取数据时随时调整获取条件.也可以用+1,2,3,4获得此四个对话框.* ^0 m6 Y9 R: H: @6 s& T3 X
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　　4、在Detectors/Amps对话框中,先为每个参数选择适当的倍增模式（amplifiermode）：线性模式Lin或对数模式Log.一般进行细胞表面抗原分析如分析外周血的淋巴细胞亚群时,FSC和SSC多以线性模式Lin测量,且DDMParam选择FL2,而FL1,FL2与FL3则以对数模式Log测量；分析细胞DNA含量时,FSC,SSC,FL1,FL2,FL3皆以Lin进行测量,且DDMParam选择FL2；分析血小板表型时,FSC,SSC,FL1,FL2,FL3等均以Log进行测量.- q3 }6 H/ X8 S) U- r
　　
& r/ X' v$ o6 b) f# o; L　　5、放上待检测的样品,将流式细胞仪设定于RUN,流速可在HIGH或LOW上.: G3 I. a% c/ T7 y4 h6 F. E$ {
　　
( n: H: u- c2 f- I/ X& q( b8 b% b　　6、在AcquisitonControl对话框中,选取Acquire,开始获取细胞.在以下的仪器调整过程中随时选取Pause,Restart以观察调整效果.未完全调整好之前不要去掉SETUP前的“?”./ x; i0 |5 C# ]' s* n6 n
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　　7、在Detectors/Amps对话框中,调整FSC和SSC探测器中的信号倍增度：PMTvoltages（粗调）与AmpGains（细调）,使样品信号出现在FSC-SSC点图内,且三群细胞合理分布.
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# i9 N9 q' v( T- J. j4 E" u　　8、在Threshold对话框中选择适当的参数设定Threshold,并调整Threshold的高低,以减少噪音信号（细胞碎片）.一般做细胞表型时用FSC－H而做DNA时用FL2－H.Threshold并不影响检测器对信号的获取,但可改善画面质量.
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- m3 \0 }, b- ^2 x4 J　　9、从屏幕左列绘图工具中选取Region（区域）,并在靶细胞周围设定区域线,即通常所说的门.圈定合适的细胞群可使仪器调整更为容易.4 R2 S! R: B9 p8 Z9 K1 f
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　　10、在Detectors/Amps对话框中,调整荧光检测器（FL1,FL2,FL3,FL4等）的倍增程度.根据所用的荧光阴性对照样品调整细胞群,使之分布在正确的区域内.; o8 x, I6 r% g6 G
　　
2 n6 `5 x3 z, l5 C7 v5 K  j　　11、在Compensation对话框中,根据所用的调补偿用标准荧光样品调整双色（或多色）荧光染色所需的荧光补偿.比如应该为FL1+FL2-的细胞群却分布在FL1＋FL2＋区域内,则需调大FL2－？％FL1中的“？”,并从FL1-FL2点图中观察新的调整是否恰当
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1 P+ ?4 D8 U9 s& l/ W1 L) D7 _4 D$ c　　12、在Status对话框中可见：LaserPower:正常值—Run/Ready为14.7mW,Standby为5mW；Lasercurrent:正常值为6Amps左右.
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  ]# {: u- }0 v; f) M; ^- g+ u　　13、调整好的仪器设定可在InstrumentSettings对话框中储存,下次进行相同实验时可调出使用,届时只需微调即可.
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　　本计算机中已有三个名叫储存于FACStationG3BDApplicationsCELLQuestFolderIMM-InstrSettings及FACStationG3BDFilesInstrumentSettingsFilesCalibFile和Mast-Cell-Set的参数文件,前二者可用于分析人白细胞,后者用于分析小鼠肥大细胞.
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( Z5 {) b; _; t! f0 R8 H& p& y　　四、通过预设的获取模式文件进行样品分析
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: n" S+ [5 C# `. P. C2 F8 v　　1、从苹果标志中选择CELLQUEST,新视窗出现后从File指令栏中选择Open,打开预设的获取模式文件.
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　　2、从屏幕上方Acquire指令栏中,选取ConnecttoCytometer进行电脑和仪器的连机.将出现的AcquisitonControl对话框移至合适位置.
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, }0 x# K3 b( |# d7 D$ I( K! c' F　　3、从Cytometer指令栏中选取InstrumentSettings,在其对话框中选择Open以调出以前存储的相同实验的仪器设定,按Set确定.
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　　4、在Acquire指令栏中,选择Acquisition&Storage决定储存的细胞数,参数,信号道数.其中Resolution在做细胞表面标志时选择256,做DNA时选择1024.ParameterSaved…则根据不同的检测对象选择不同的参数., [/ t) K; ^7 `' f+ a
　　
4 y: _; p0 e7 n4 Z　　5、在Acquire指令栏中,选择ParameterDescription,以决定文件存储位置（folder）,文件名称（file）,样品代号以及各种参数的标记（panel）,即安排tube1,2,3…的检测参数.一般本仪器获取的数据按照检测对象的不同分别储存于FACStationG3BDApplicationsCELLQuestIMM和DNA文件夹中.文件根据日期命名.( V: \6 r/ h& A7 H" v
　　
+ X' L. l3 c/ n0 G, L( `, E8 o0 l　　6、在Cytometer指令栏中,选择Counters,将此对话框移至合适位置,以便于随时观察events计数.
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* `" [8 h1 F. _# E" e& U+ p　　7、将样品试管放至检测区,在AcquireControl对话框中选取Acquire以启动样品分析测定., u, @- F6 H6 j+ ^
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　　8、微调仪器设定,待细胞群分布合适后选择AcquireControl对话框中Pause,Abort,去除Setup前的“?”,开始正式获取信号,存储数据.
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　　9、当一定数目的细胞被测定后,获取会自动停止,并会自动存储数据.重复步骤7,继续分析下一个样品,直到所有的样品数据分析完毕.
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/ A* m, O9 G0 S1 [/ z+ r　　当所有样品分析分析完毕,即换上三蒸水,并将流式细胞仪置于“STANDBY”状态,以保护激光管.
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: w! l& t9 ~) U" N0 F1 Y　　五、关机程序
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( n: `' S8 N" l& N/ }, G" T　　1、从File中选择Quit,退出软件,选择Don’tSave至苹果屏幕.0 k- x# Y* V- D/ t- W: k
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　　2、用4ml1：10稀释的漂白水作样品,将样品置于旁位（vacuumison）,以外管吸去约2ml,在将样品架置于中位（vacuumisoff）,再HIGHRUN5分钟（内管吸去2ml）.
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7 K# _4 B( D  y　　3、改用三蒸水4ml作样品,同上处理.
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% p+ ~0 n4 t, x1 |8 t: X　　4、按Prime三次.
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$ k" [8 A4 j4 u2 R* M% y　　5、此时仪器自动转为STANDBY状态,换2ml三蒸水.必须在仪器处于“STANDBY”状态10分钟后再依次关掉计算机、打印机、主机、稳压电源,以延长激光管寿命,并确保应用软件的正常运行.( o( ?# I( [+ O/ s% [, X/ F
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　　6、填写使用登记表.
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