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本帖最后由 细胞海洋 于 2016-1-8 08:29 编辑
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- V- B/ L1 q `2 g一、开机程序
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1、检查稳压器电源,打开电源,稳定5分钟.
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/ T, C$ Y; w0 B7 d9 { 2、打开储液箱,倒掉废液,并在废液桶中加入400ml漂白水原液.打开压力阀,取出鞘液桶,将鞘液桶加至4/5满（一般可用三蒸水,做分选必须用PBS或FACSFlow）,合上压力阀.确实盖紧桶盖,检查所有管路是否妥善安置.8 t9 ]8 k& o, O
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3、将FACSCalibur开关打开,此时仪器功能控制钮的显示应是STANDBY,预热5－10分钟.排出过滤器内的气泡.
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4、如果需要打印,打开打印机电源." y: M& R6 I% w! R. Z) `+ j5 f
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5、打开电脑,等待屏幕显示出标准的苹果标志.
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6、执行仪器PRIME功能一次,以排除Flowcell中的气泡.4 h# a4 i9 @9 g7 V% R' f6 n
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7、分析样品时,先用FACAFlow或PBS进行HIGHRUN约2分钟.
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1 E. x/ I, {) V 做过分选后,每次开机后需冲洗管道：向分选装置上装上两个50ml离心管,不接通浓缩系统,摁下右下角白色按钮开始冲洗.待自动停止后接通浓缩装置,同上法冲洗一次.: y! s$ c8 ~" G8 r3 K' ]
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二、预设获取模式文件（AcquisitionTemplateFiles）: `- N9 L4 A k7 u" @. H
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1、从苹果标志中选择CELLQuest见一个新视窗,可利用此视窗编辑一个获取模式文件.
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3 Z9 i: w3 V9 s F; U F9 w" h5 { 2、选取屏幕左列绘图工具中的Dotplot,绘出一个或多个DotPlots（点图）.从DotPlot对话框中选取Acquisition作为图形资料来源,并确定适当的x轴和y轴参数.
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7 A1 K; D6 j3 D* M) } 3、选取屏幕左列绘图工具中的Histogram,同上法可绘出Histogram（直方图）.: V; R' I$ @; Q4 X
/ w, b( Z8 @0 Q' r& f 4、将此视窗命名后储存于FACStationG3BDApplicationsCELLQuestFolderEXP文件夹中,下次进行相同实验时可直接调用.* |- p4 K) q$ v# f! F$ s8 ^
. {. o1 S9 H0 h" K" r 本计算机中已设定两个模式文件：ACQ和EXP,储存于FACStationG3BDApplicationsCELLQuestEXP文件夹中,ACQ用于细胞DNA检测，EXP用于细胞表面标志分析.
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; j) Y# Q6 _/ e+ f% p 三、用CELLQuest进行仪器的设定和调整3 ]1 [# q9 x5 ]: W7 F! D
" y: n. u1 F$ K$ w6 E. F 1、从苹果画面中选取CELLQuest,进入CELLQuest后在File指令栏中打开合适的获取模式文件.
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* j* E4 ?$ F; P4 P 2、从屏幕上方Acquire指令栏中,选取ConnecttoCytometer（快捷键：＋B）进行电脑和仪器的连机.将出现的AcquisitonControl对话框移至合适位置.+ j E/ x7 b: O% Q
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3、从Cytometer指令栏中,开启Detectors/Amps、Threshold、Compensation、Status等四个对话框,并将它们移至屏幕右方,以便获取数据时随时调整获取条件.也可以用+1,2,3,4获得此四个对话框." Y3 q/ n* U8 E
( p4 v! @* D+ L$ F+ s1 R 4、在Detectors/Amps对话框中,先为每个参数选择适当的倍增模式（amplifiermode）：线性模式Lin或对数模式Log.一般进行细胞表面抗原分析如分析外周血的淋巴细胞亚群时,FSC和SSC多以线性模式Lin测量,且DDMParam选择FL2,而FL1,FL2与FL3则以对数模式Log测量；分析细胞DNA含量时,FSC,SSC,FL1,FL2,FL3皆以Lin进行测量,且DDMParam选择FL2；分析血小板表型时,FSC,SSC,FL1,FL2,FL3等均以Log进行测量.% }! _) n$ ~; x- h- f/ [& F4 p- L
0 W! N# ]! f& Z8 n! ]. k 5、放上待检测的样品,将流式细胞仪设定于RUN,流速可在HIGH或LOW上.& \2 o" @& _* z/ M' O- _5 J" l ~
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6、在AcquisitonControl对话框中,选取Acquire,开始获取细胞.在以下的仪器调整过程中随时选取Pause,Restart以观察调整效果.未完全调整好之前不要去掉SETUP前的“?”.9 Q. t9 z/ ?' A9 }$ [5 l4 Q3 z3 a
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7、在Detectors/Amps对话框中,调整FSC和SSC探测器中的信号倍增度：PMTvoltages（粗调）与AmpGains（细调）,使样品信号出现在FSC-SSC点图内,且三群细胞合理分布.4 f+ _2 T0 M2 ~) r
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8、在Threshold对话框中选择适当的参数设定Threshold,并调整Threshold的高低,以减少噪音信号（细胞碎片）.一般做细胞表型时用FSC－H而做DNA时用FL2－H.Threshold并不影响检测器对信号的获取,但可改善画面质量.4 p% N* a* \$ S3 U3 \, p9 Q8 k# t/ k
3 `3 g3 H& [/ |4 S3 ]' S" V 9、从屏幕左列绘图工具中选取Region（区域）,并在靶细胞周围设定区域线,即通常所说的门.圈定合适的细胞群可使仪器调整更为容易.9 G( G) u5 y, R: a2 x! v
- n. a) |) ?8 r7 B- D* P 10、在Detectors/Amps对话框中,调整荧光检测器（FL1,FL2,FL3,FL4等）的倍增程度.根据所用的荧光阴性对照样品调整细胞群,使之分布在正确的区域内.
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* F/ W/ {* x* ]# P) j3 \ 11、在Compensation对话框中,根据所用的调补偿用标准荧光样品调整双色（或多色）荧光染色所需的荧光补偿.比如应该为FL1+FL2-的细胞群却分布在FL1＋FL2＋区域内,则需调大FL2－？％FL1中的“？”,并从FL1-FL2点图中观察新的调整是否恰当( d6 |% i0 J9 `( u& I: X
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12、在Status对话框中可见：LaserPower:正常值—Run/Ready为14.7mW,Standby为5mW；Lasercurrent:正常值为6Amps左右., U9 a% _0 W" j1 k6 m
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13、调整好的仪器设定可在InstrumentSettings对话框中储存,下次进行相同实验时可调出使用,届时只需微调即可.
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# h) E6 N) o+ ~ P 本计算机中已有三个名叫储存于FACStationG3BDApplicationsCELLQuestFolderIMM-InstrSettings及FACStationG3BDFilesInstrumentSettingsFilesCalibFile和Mast-Cell-Set的参数文件,前二者可用于分析人白细胞,后者用于分析小鼠肥大细胞.1 ^ e2 S5 I% M* [7 q3 J- ^
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四、通过预设的获取模式文件进行样品分析2 O# l" @8 G- f- m: T3 V% F
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1、从苹果标志中选择CELLQUEST,新视窗出现后从File指令栏中选择Open,打开预设的获取模式文件.
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2、从屏幕上方Acquire指令栏中,选取ConnecttoCytometer进行电脑和仪器的连机.将出现的AcquisitonControl对话框移至合适位置.
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3、从Cytometer指令栏中选取InstrumentSettings,在其对话框中选择Open以调出以前存储的相同实验的仪器设定,按Set确定.- o C& |3 r y$ c* x" u3 l
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4、在Acquire指令栏中,选择Acquisition&Storage决定储存的细胞数,参数,信号道数.其中Resolution在做细胞表面标志时选择256,做DNA时选择1024.ParameterSaved…则根据不同的检测对象选择不同的参数.
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8 i- O: A) s' E! `8 R* \% L: c: j 5、在Acquire指令栏中,选择ParameterDescription,以决定文件存储位置（folder）,文件名称（file）,样品代号以及各种参数的标记（panel）,即安排tube1,2,3…的检测参数.一般本仪器获取的数据按照检测对象的不同分别储存于FACStationG3BDApplicationsCELLQuestIMM和DNA文件夹中.文件根据日期命名.
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5 m) y5 g) n' r1 ^ 6、在Cytometer指令栏中,选择Counters,将此对话框移至合适位置,以便于随时观察events计数.4 s5 u" {( w& T+ Y2 K# d( `& f
' I! ~9 _ N6 r6 ?3 X; p 7、将样品试管放至检测区,在AcquireControl对话框中选取Acquire以启动样品分析测定.4 Y& X, A' F1 y5 k, s4 [: |& ^' K
|( I3 ?! v1 G: E: N 8、微调仪器设定,待细胞群分布合适后选择AcquireControl对话框中Pause,Abort,去除Setup前的“?”,开始正式获取信号,存储数据., c% m4 l H. w) X4 S- S/ ? k
, F' x6 Z& j" Q 9、当一定数目的细胞被测定后,获取会自动停止,并会自动存储数据.重复步骤7,继续分析下一个样品,直到所有的样品数据分析完毕.
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当所有样品分析分析完毕,即换上三蒸水,并将流式细胞仪置于“STANDBY”状态,以保护激光管.& ]: v+ C8 D; n5 l k
- w3 A; r2 x0 D 五、关机程序
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1、从File中选择Quit,退出软件,选择Don’tSave至苹果屏幕.
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9 S9 [# V2 J9 f2 m 2、用4ml1：10稀释的漂白水作样品,将样品置于旁位（vacuumison）,以外管吸去约2ml,在将样品架置于中位（vacuumisoff）,再HIGHRUN5分钟（内管吸去2ml）.0 q0 F* u" J3 d9 j
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3、改用三蒸水4ml作样品,同上处理.
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4、按Prime三次.3 q( f& B1 d% _# l8 |: S
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5、此时仪器自动转为STANDBY状态,换2ml三蒸水.必须在仪器处于“STANDBY”状态10分钟后再依次关掉计算机、打印机、主机、稳压电源,以延长激光管寿命,并确保应用软件的正常运行.# I+ A; g& d9 _$ U& S9 K4 e
) A* f: [# n6 p$ _; U 6、填写使用登记表.
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发表于 2016-1-8 00:58
