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本帖最后由 细胞海洋 于 2016-1-8 08:29 编辑
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一、开机程序
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1、检查稳压器电源,打开电源,稳定5分钟.* _2 x0 z) Z2 z
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2、打开储液箱,倒掉废液,并在废液桶中加入400ml漂白水原液.打开压力阀,取出鞘液桶,将鞘液桶加至4/5满（一般可用三蒸水,做分选必须用PBS或FACSFlow）,合上压力阀.确实盖紧桶盖,检查所有管路是否妥善安置.
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3、将FACSCalibur开关打开,此时仪器功能控制钮的显示应是STANDBY,预热5－10分钟.排出过滤器内的气泡.; N3 S6 A& \2 r. n5 m: ?
6 J/ s" [& V$ C* |0 Z% b8 D9 L 4、如果需要打印,打开打印机电源., V% K& H. `8 u, t7 @
% H: f: `2 U+ T6 t$ {6 z 5、打开电脑,等待屏幕显示出标准的苹果标志.
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6、执行仪器PRIME功能一次,以排除Flowcell中的气泡.; Q0 h/ G! o. t
0 n) o# Q3 O: M# [ 7、分析样品时,先用FACAFlow或PBS进行HIGHRUN约2分钟.
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做过分选后,每次开机后需冲洗管道：向分选装置上装上两个50ml离心管,不接通浓缩系统,摁下右下角白色按钮开始冲洗.待自动停止后接通浓缩装置,同上法冲洗一次./ f3 T5 _: D# K; u2 x* h
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二、预设获取模式文件（AcquisitionTemplateFiles）
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2 D( V% G7 ]: C C 1、从苹果标志中选择CELLQuest见一个新视窗,可利用此视窗编辑一个获取模式文件.
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# a2 m) T3 S9 V& W 2、选取屏幕左列绘图工具中的Dotplot,绘出一个或多个DotPlots（点图）.从DotPlot对话框中选取Acquisition作为图形资料来源,并确定适当的x轴和y轴参数.
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3、选取屏幕左列绘图工具中的Histogram,同上法可绘出Histogram（直方图）.
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4、将此视窗命名后储存于FACStationG3BDApplicationsCELLQuestFolderEXP文件夹中,下次进行相同实验时可直接调用.
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# R$ `6 p; f0 d2 Q* b1 K4 y 本计算机中已设定两个模式文件：ACQ和EXP,储存于FACStationG3BDApplicationsCELLQuestEXP文件夹中,ACQ用于细胞DNA检测，EXP用于细胞表面标志分析.
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三、用CELLQuest进行仪器的设定和调整
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* J/ x7 P8 N; H/ P; G% V 1、从苹果画面中选取CELLQuest,进入CELLQuest后在File指令栏中打开合适的获取模式文件.
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# |" D& ], X. \' H6 _4 G# D8 P 2、从屏幕上方Acquire指令栏中,选取ConnecttoCytometer（快捷键：＋B）进行电脑和仪器的连机.将出现的AcquisitonControl对话框移至合适位置.' w# b4 o- @% z7 x$ p4 f0 c- V
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3、从Cytometer指令栏中,开启Detectors/Amps、Threshold、Compensation、Status等四个对话框,并将它们移至屏幕右方,以便获取数据时随时调整获取条件.也可以用+1,2,3,4获得此四个对话框.
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4、在Detectors/Amps对话框中,先为每个参数选择适当的倍增模式（amplifiermode）：线性模式Lin或对数模式Log.一般进行细胞表面抗原分析如分析外周血的淋巴细胞亚群时,FSC和SSC多以线性模式Lin测量,且DDMParam选择FL2,而FL1,FL2与FL3则以对数模式Log测量；分析细胞DNA含量时,FSC,SSC,FL1,FL2,FL3皆以Lin进行测量,且DDMParam选择FL2；分析血小板表型时,FSC,SSC,FL1,FL2,FL3等均以Log进行测量.4 d7 V) B" C- d; E* [; u. N
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5、放上待检测的样品,将流式细胞仪设定于RUN,流速可在HIGH或LOW上.( x( j9 l5 P8 f& W' x% Q
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6、在AcquisitonControl对话框中,选取Acquire,开始获取细胞.在以下的仪器调整过程中随时选取Pause,Restart以观察调整效果.未完全调整好之前不要去掉SETUP前的“?”.' ]) h# _2 m, ^* ]
: c V! F+ n$ J- K( F: [! d: _ 7、在Detectors/Amps对话框中,调整FSC和SSC探测器中的信号倍增度：PMTvoltages（粗调）与AmpGains（细调）,使样品信号出现在FSC-SSC点图内,且三群细胞合理分布.
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8、在Threshold对话框中选择适当的参数设定Threshold,并调整Threshold的高低,以减少噪音信号（细胞碎片）.一般做细胞表型时用FSC－H而做DNA时用FL2－H.Threshold并不影响检测器对信号的获取,但可改善画面质量.5 F! s5 ^6 c; L
& F' V4 ? l7 [ 9、从屏幕左列绘图工具中选取Region（区域）,并在靶细胞周围设定区域线,即通常所说的门.圈定合适的细胞群可使仪器调整更为容易.7 w0 e! R& R9 G2 _6 e, K" S; I
7 `2 L& _7 {0 `6 i9 E# r 10、在Detectors/Amps对话框中,调整荧光检测器（FL1,FL2,FL3,FL4等）的倍增程度.根据所用的荧光阴性对照样品调整细胞群,使之分布在正确的区域内.5 b: q# {$ r ]" w' q
# R0 k* E9 b* F$ S$ I 11、在Compensation对话框中,根据所用的调补偿用标准荧光样品调整双色（或多色）荧光染色所需的荧光补偿.比如应该为FL1+FL2-的细胞群却分布在FL1＋FL2＋区域内,则需调大FL2－？％FL1中的“？”,并从FL1-FL2点图中观察新的调整是否恰当1 {3 t! C; i* E9 `, c: n8 H) c
. z- J% A+ q q7 S8 m' ?+ }. K 12、在Status对话框中可见：LaserPower:正常值—Run/Ready为14.7mW,Standby为5mW；Lasercurrent:正常值为6Amps左右.
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" J J9 h P3 k. q% C 13、调整好的仪器设定可在InstrumentSettings对话框中储存,下次进行相同实验时可调出使用,届时只需微调即可.
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本计算机中已有三个名叫储存于FACStationG3BDApplicationsCELLQuestFolderIMM-InstrSettings及FACStationG3BDFilesInstrumentSettingsFilesCalibFile和Mast-Cell-Set的参数文件,前二者可用于分析人白细胞,后者用于分析小鼠肥大细胞.' L" r! S1 U8 K. ^) ~5 S
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四、通过预设的获取模式文件进行样品分析
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1、从苹果标志中选择CELLQUEST,新视窗出现后从File指令栏中选择Open,打开预设的获取模式文件.1 l4 j5 d0 K/ d O; N q& I
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2、从屏幕上方Acquire指令栏中,选取ConnecttoCytometer进行电脑和仪器的连机.将出现的AcquisitonControl对话框移至合适位置.
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3、从Cytometer指令栏中选取InstrumentSettings,在其对话框中选择Open以调出以前存储的相同实验的仪器设定,按Set确定.4 I: `$ P+ S, T E/ I
" I& A5 M; s$ a! A( O 4、在Acquire指令栏中,选择Acquisition&Storage决定储存的细胞数,参数,信号道数.其中Resolution在做细胞表面标志时选择256,做DNA时选择1024.ParameterSaved…则根据不同的检测对象选择不同的参数.
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, j% ^9 A0 l: }3 y+ G$ K, c 5、在Acquire指令栏中,选择ParameterDescription,以决定文件存储位置（folder）,文件名称（file）,样品代号以及各种参数的标记（panel）,即安排tube1,2,3…的检测参数.一般本仪器获取的数据按照检测对象的不同分别储存于FACStationG3BDApplicationsCELLQuestIMM和DNA文件夹中.文件根据日期命名.. d# r7 f) t' O# |% z+ ?
) |! H% Q3 c# V 6、在Cytometer指令栏中,选择Counters,将此对话框移至合适位置,以便于随时观察events计数.
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2 G6 Q6 c M( i% c+ U" V 7、将样品试管放至检测区,在AcquireControl对话框中选取Acquire以启动样品分析测定.
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$ h! d I' T1 D" k1 a! Q 8、微调仪器设定,待细胞群分布合适后选择AcquireControl对话框中Pause,Abort,去除Setup前的“?”,开始正式获取信号,存储数据.# l( I+ x! ?2 N$ c
9 H7 q) x5 l) A) s8 V 9、当一定数目的细胞被测定后,获取会自动停止,并会自动存储数据.重复步骤7,继续分析下一个样品,直到所有的样品数据分析完毕.$ d9 }" Z Q8 \1 M2 }
( S. ` f4 P; W6 r, ?% x/ | 当所有样品分析分析完毕,即换上三蒸水,并将流式细胞仪置于“STANDBY”状态,以保护激光管.1 o$ K# B0 c' r8 G1 M* W
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五、关机程序
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1、从File中选择Quit,退出软件,选择Don’tSave至苹果屏幕., z6 k W% o: Y6 e7 n) P; h8 c/ ?, |
: ?. ~% N& c2 H5 C' \ 2、用4ml1：10稀释的漂白水作样品,将样品置于旁位（vacuumison）,以外管吸去约2ml,在将样品架置于中位（vacuumisoff）,再HIGHRUN5分钟（内管吸去2ml）.
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4 Z1 E. N# z7 `( k; J5 t: F0 E$ \ 3、改用三蒸水4ml作样品,同上处理.
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0 J8 [* G4 N( c; V8 \: J* E D 4、按Prime三次.
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* e0 U. {& k% N# F: j 5、此时仪器自动转为STANDBY状态,换2ml三蒸水.必须在仪器处于“STANDBY”状态10分钟后再依次关掉计算机、打印机、主机、稳压电源,以延长激光管寿命,并确保应用软件的正常运行.
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6、填写使用登记表.
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发表于 2016-1-8 00:58
