跑胶出现三条带？

gxbzjznn

P基因跑胶SOX2居然出现三条带？大家帮我分析一下我的这张电泳图毛病（任何毛病的地方都可以），欢迎批评指导

nichifanlema2

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1 v' ^: Y2 D8 m& x  _1 N
! m% [4 \4 |: I1 `0 D* [7 ^引物二聚体的出现不一定会出现在每次扩增和其它基因的扩增中，其跟引物的设计有关。个人认为，在基因扩增时，引物的都是过量的，如果两对引物直接有4个（含）以上的碱基配对，引物二聚体就常常会出现，在不影响基因扩增和表达趋势的情况下，可以忽略不计。通常使用时的引物浓度为10uM,如果引物二聚体较为明显，或者影响了扩增，可以适当降低引物浓度。另外，为了提高扩增效率和扩增时的特异性，可以提高退火温度。

云飘过的思念

/ z/ L$ s; }) g. T" i

gxbzjznn 发表于 2016-1-13 22:38
& i5 S3 y4 q. u- Y  l) V. j回复 nichifanlema2 的帖子- l/ H" U7 ^- h! o
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我是按照引物合成回来以后引物管上标注的体积加对应的TE buffer溶解以后再用水 ...

; E$ s) E* K9 l  N+ ]. @: F
* g& I: F" F3 N: k; [1 A: O& U我们之前溶解引物的方法如下，仅供参考
: U* r: d! \( _, i实测浓度（ng/ul）=实测260值*33*稀释倍数
! g! o/ u& [' y实际浓度（uM）= 实测浓度（ng/ul）*1000/M.W
# J' Z. i9 @& l, _0 b3 k' A) `# u补水量（ul）= 实际浓度（uM）*（总体积-测OD消耗体积）/定溶浓度（uM）- （总体积-测OD消耗体积）
; S: B' k6 H; O" ?" F- |1 u) U; N  U1 D
定量设备为NanoDorp2000

云飘过的思念

5 l3 I& `$ s6 C4 r$ U& `7 M) D& M

  `- c9 v' ^1 w/ E回复 gxbzjznn 的帖子3 e+ A' ?2 B% ?5 I* B0 ^$ q! {2 S
' s* v8 K' n, L6 D' O
恩，具体染料可以分很多种，只要能在特定波长激发光下发光即可，但是染色方法是胶染哈，嘿嘿

gxbzjznn

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! `- `0 F6 h7 J9 Q2 ~" O, I. G1 L" p( `
我是按照引物合成回来以后引物管上标注的体积加对应的TE buffer溶解以后再用水稀释十倍的 （取10ul到另一个新的1.5ml离心管再加90ul无酶水） ！  这样浓度还大的话该怎么稀释呢？你们一般都是怎么稀释引物呢？

gxbzjznn

回复 云飘过的思念 的帖子5 R, q9 K5 Z8 D) s1 E1 K3 i
! s+ Y" o8 i. x7 _* s1 z
我们用核酸染料是Gelview

gxbzjznn

回复 king8 的帖子4 Q' D9 R7 I, f0 T% Y& D! p
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不可能是特异性扩增吧？因为片段差距很大啊 我的product length 是200bp  中间还有最下面的都在50bp以下  另外请问一下 你们设计引物的时候看Self complementarity 以及Self 3' complementarity的值么？他们跟TM值以及GC含量之间有冲突时该如何选择？有优先选择顺序码？谢谢

gxbzjznn

回复 nichifanlema2 的帖子; O4 ~# m+ R- {. d5 Q
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Takara

gxbzjznn

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1 ?+ a3 T( @" O6 g
3 w; I/ w8 P6 M) }: j) E! _不可能是特异性扩增吧？因为片段差距很大啊 我的product length 是200bp  中间还有最下面的都在50bp以下  另外请问一下 你们设计引物的时候看Self complementarity 以及Self 3' complementarity的值么？他们跟TM值以及GC含量之间有冲突时该如何选择？有优先选择顺序码？谢谢

gxbzjznn

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4 @) E8 J5 S# ~7 E- J
7 W8 i9 S" g6 u6 F  b我也觉得中间是引物二聚体 但是我做的其他基因就没有这种情况