跑胶出现三条带？

gxbzjznn

P基因跑胶SOX2居然出现三条带？大家帮我分析一下我的这张电泳图毛病（任何毛病的地方都可以），欢迎批评指导

nichifanlema2

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3 k/ C( ~/ e8 b) S& j; H
) w6 @; B/ L% M0 G0 j% l引物二聚体的出现不一定会出现在每次扩增和其它基因的扩增中，其跟引物的设计有关。个人认为，在基因扩增时，引物的都是过量的，如果两对引物直接有4个（含）以上的碱基配对，引物二聚体就常常会出现，在不影响基因扩增和表达趋势的情况下，可以忽略不计。通常使用时的引物浓度为10uM,如果引物二聚体较为明显，或者影响了扩增，可以适当降低引物浓度。另外，为了提高扩增效率和扩增时的特异性，可以提高退火温度。

云飘过的思念

8 N: v' n& @, ?2 [4 T/ U

gxbzjznn 发表于 2016-1-13 22:38
" s# l9 d$ m# w+ }) Q回复 nichifanlema2 的帖子
3 c# J: ~0 }8 _' _7 L
' X0 B. P) G9 n/ L8 S+ W我是按照引物合成回来以后引物管上标注的体积加对应的TE buffer溶解以后再用水 ...

& _9 k4 S% e' D" T' g3 {

# i/ i0 g2 j6 P4 b3 K  C5 {8 ~我们之前溶解引物的方法如下，仅供参考: [9 n9 P8 \0 y) t/ H$ a
实测浓度（ng/ul）=实测260值*33*稀释倍数# T) J7 u$ }- ]. C6 S2 S6 Q  q
实际浓度（uM）= 实测浓度（ng/ul）*1000/M.W( c" u9 g0 L& b
补水量（ul）= 实际浓度（uM）*（总体积-测OD消耗体积）/定溶浓度（uM）- （总体积-测OD消耗体积）
  C) Z( d9 B9 ]+ k/ g6 ]
" w( [# M) ~) @" j0 q8 Y- q/ ^0 |定量设备为NanoDorp2000

云飘过的思念

* X6 x7 ^" l& j. [
' G/ y/ u# P, x! c/ T9 L; ]回复 gxbzjznn 的帖子
; z3 m8 b. O: b4 A, I8 u$ h: P4 U( a6 v0 h: p1 ~4 i* c
恩，具体染料可以分很多种，只要能在特定波长激发光下发光即可，但是染色方法是胶染哈，嘿嘿

gxbzjznn

回复 nichifanlema2 的帖子; e6 l% k! H$ i1 x( Q" Z
: J8 s+ A, J9 C) }$ O& ?
我是按照引物合成回来以后引物管上标注的体积加对应的TE buffer溶解以后再用水稀释十倍的 （取10ul到另一个新的1.5ml离心管再加90ul无酶水） ！  这样浓度还大的话该怎么稀释呢？你们一般都是怎么稀释引物呢？

gxbzjznn

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8 Z- s- s2 _  Y. _3 T6 [
4 L2 l$ P  J6 d" B* Z$ G' Y# w* u$ t我们用核酸染料是Gelview

gxbzjznn

回复 king8 的帖子5 h' i7 @- T1 U* o7 k9 M

; d. S( t* x% O  _4 i. T) t, ^不可能是特异性扩增吧？因为片段差距很大啊 我的product length 是200bp  中间还有最下面的都在50bp以下  另外请问一下 你们设计引物的时候看Self complementarity 以及Self 3' complementarity的值么？他们跟TM值以及GC含量之间有冲突时该如何选择？有优先选择顺序码？谢谢

gxbzjznn

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3 v" N/ X$ C- }# u! M1 {: [6 i5 n/ x5 a# B7 U
Takara

gxbzjznn

回复 thinktank 的帖子7 ~( x" R- d  U
# L6 D2 H5 R# R6 F6 m
不可能是特异性扩增吧？因为片段差距很大啊 我的product length 是200bp  中间还有最下面的都在50bp以下  另外请问一下 你们设计引物的时候看Self complementarity 以及Self 3' complementarity的值么？他们跟TM值以及GC含量之间有冲突时该如何选择？有优先选择顺序码？谢谢

gxbzjznn

回复 nichifanlema2 的帖子: t" c5 K) C& V9 b. v3 [

& Q& T9 i0 |$ U! H. |; X7 x我也觉得中间是引物二聚体 但是我做的其他基因就没有这种情况