跑胶出现三条带？

gxbzjznn

P基因跑胶SOX2居然出现三条带？大家帮我分析一下我的这张电泳图毛病（任何毛病的地方都可以），欢迎批评指导

nichifanlema2

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' R9 R/ ?5 `4 N( n
引物二聚体的出现不一定会出现在每次扩增和其它基因的扩增中，其跟引物的设计有关。个人认为，在基因扩增时，引物的都是过量的，如果两对引物直接有4个（含）以上的碱基配对，引物二聚体就常常会出现，在不影响基因扩增和表达趋势的情况下，可以忽略不计。通常使用时的引物浓度为10uM,如果引物二聚体较为明显，或者影响了扩增，可以适当降低引物浓度。另外，为了提高扩增效率和扩增时的特异性，可以提高退火温度。

云飘过的思念

- a7 h+ t" V# I9 E. O+ [1 T

gxbzjznn 发表于 2016-1-13 22:38 6 n7 e8 S: }* Y, H! G& C
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0 j" B* h* D. h. p: T2 `& \: t# D9 k! Z9 K. ]
我是按照引物合成回来以后引物管上标注的体积加对应的TE buffer溶解以后再用水 ...

' c' l$ G! F# X5 i3 _. \. K: K; l# `5 M. m% E( j4 Y
我们之前溶解引物的方法如下，仅供参考- a: i/ @+ e6 V5 \: |
实测浓度（ng/ul）=实测260值*33*稀释倍数
  b+ }8 d% p" v5 o8 h实际浓度（uM）= 实测浓度（ng/ul）*1000/M.W
7 H- _7 p! N2 B  x3 F" F补水量（ul）= 实际浓度（uM）*（总体积-测OD消耗体积）/定溶浓度（uM）- （总体积-测OD消耗体积）
5 n" p7 r$ m9 K2 ?" X  O( R
  P- |5 L- x. J* }定量设备为NanoDorp2000

云飘过的思念

( v' o0 o/ A; R: U8 p  {" ~% R8 R  ~
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( E, l8 s# m  z; {/ W7 U" F1 j; r7 A3 f3 K
恩，具体染料可以分很多种，只要能在特定波长激发光下发光即可，但是染色方法是胶染哈，嘿嘿

gxbzjznn

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+ t' E+ N# o9 c+ T* k' I5 E我是按照引物合成回来以后引物管上标注的体积加对应的TE buffer溶解以后再用水稀释十倍的 （取10ul到另一个新的1.5ml离心管再加90ul无酶水） ！  这样浓度还大的话该怎么稀释呢？你们一般都是怎么稀释引物呢？

gxbzjznn

回复 云飘过的思念 的帖子3 _0 F- Q" F& T+ n) D2 [

! e3 u: E" p% ?1 @; j* t% I, _, I. ^我们用核酸染料是Gelview

gxbzjznn

回复 king8 的帖子# O( i6 n1 Q: Y8 V, {
/ ^; z, T* I+ W. L
不可能是特异性扩增吧？因为片段差距很大啊 我的product length 是200bp  中间还有最下面的都在50bp以下  另外请问一下 你们设计引物的时候看Self complementarity 以及Self 3' complementarity的值么？他们跟TM值以及GC含量之间有冲突时该如何选择？有优先选择顺序码？谢谢

gxbzjznn

回复 nichifanlema2 的帖子6 Z3 u: w0 O+ R( N, v
* S, [2 z7 x2 P, `  j" R
Takara

gxbzjznn

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& U% P1 {! F" Q& T7 e3 i
1 r& x, u6 ~* h: }8 m" q不可能是特异性扩增吧？因为片段差距很大啊 我的product length 是200bp  中间还有最下面的都在50bp以下  另外请问一下 你们设计引物的时候看Self complementarity 以及Self 3' complementarity的值么？他们跟TM值以及GC含量之间有冲突时该如何选择？有优先选择顺序码？谢谢

gxbzjznn

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8 w9 d9 J" x- H% J/ G* L) w' C; D1 y
8 `& d) f' g! O7 M我也觉得中间是引物二聚体 但是我做的其他基因就没有这种情况