跑胶出现三条带？

gxbzjznn

P基因跑胶SOX2居然出现三条带？大家帮我分析一下我的这张电泳图毛病（任何毛病的地方都可以），欢迎批评指导

nichifanlema2

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' [4 y5 m4 S4 I) o* v引物二聚体的出现不一定会出现在每次扩增和其它基因的扩增中，其跟引物的设计有关。个人认为，在基因扩增时，引物的都是过量的，如果两对引物直接有4个（含）以上的碱基配对，引物二聚体就常常会出现，在不影响基因扩增和表达趋势的情况下，可以忽略不计。通常使用时的引物浓度为10uM,如果引物二聚体较为明显，或者影响了扩增，可以适当降低引物浓度。另外，为了提高扩增效率和扩增时的特异性，可以提高退火温度。

云飘过的思念

' P. J- N3 c5 [# J" w* F# e/ p1 w

gxbzjznn 发表于 2016-1-13 22:38
5 u$ E! O6 `. n: s" o回复 nichifanlema2 的帖子
, D0 @# x- b. o/ z$ Y
* B& ~1 r9 f, K: m! U我是按照引物合成回来以后引物管上标注的体积加对应的TE buffer溶解以后再用水 ...

+ A* x5 Q6 u0 `1 D' c
% ~2 E4 \  M, A2 _! a我们之前溶解引物的方法如下，仅供参考
9 L% P& [6 t( `! p7 |实测浓度（ng/ul）=实测260值*33*稀释倍数5 s! i  S( g5 N: Q( J7 M! N5 L
实际浓度（uM）= 实测浓度（ng/ul）*1000/M.W) O. I: \3 c9 r' z9 [- n
补水量（ul）= 实际浓度（uM）*（总体积-测OD消耗体积）/定溶浓度（uM）- （总体积-测OD消耗体积）8 N4 |+ J1 i6 l  _
& d3 l. m3 A$ }) n, V
定量设备为NanoDorp2000

云飘过的思念

  c/ w% g$ N# Y+ f2 m6 ?
+ `$ ^0 g; L0 O回复 gxbzjznn 的帖子
  \$ {, ~  C8 s7 w9 M
) ]+ m9 s  O9 Z' X* q3 F) m9 |恩，具体染料可以分很多种，只要能在特定波长激发光下发光即可，但是染色方法是胶染哈，嘿嘿

gxbzjznn

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. r' o8 A" A4 Z- M" p" O4 H
/ _! _+ P& G' _- Z' U  K我是按照引物合成回来以后引物管上标注的体积加对应的TE buffer溶解以后再用水稀释十倍的 （取10ul到另一个新的1.5ml离心管再加90ul无酶水） ！  这样浓度还大的话该怎么稀释呢？你们一般都是怎么稀释引物呢？

gxbzjznn

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6 [9 o5 z- u6 v) v. u
+ _; S) k; w- w7 ?7 v0 b我们用核酸染料是Gelview

gxbzjznn

回复 king8 的帖子
3 H! y! g% g. h
2 H7 m4 _; m' H* \; J8 U不可能是特异性扩增吧？因为片段差距很大啊 我的product length 是200bp  中间还有最下面的都在50bp以下  另外请问一下 你们设计引物的时候看Self complementarity 以及Self 3' complementarity的值么？他们跟TM值以及GC含量之间有冲突时该如何选择？有优先选择顺序码？谢谢

gxbzjznn

回复 nichifanlema2 的帖子+ Y! J2 s4 S) G/ p( B

) |) a. y/ T% ^Takara

gxbzjznn

回复 thinktank 的帖子2 x6 G/ s% m1 d
% l. g% N* U6 \
不可能是特异性扩增吧？因为片段差距很大啊 我的product length 是200bp  中间还有最下面的都在50bp以下  另外请问一下 你们设计引物的时候看Self complementarity 以及Self 3' complementarity的值么？他们跟TM值以及GC含量之间有冲突时该如何选择？有优先选择顺序码？谢谢

gxbzjznn

回复 nichifanlema2 的帖子) X( z9 N. X8 D  V
4 X3 Z; t9 m" L* C4 y
我也觉得中间是引物二聚体 但是我做的其他基因就没有这种情况