跑胶出现三条带？

gxbzjznn

P基因跑胶SOX2居然出现三条带？大家帮我分析一下我的这张电泳图毛病（任何毛病的地方都可以），欢迎批评指导

nichifanlema2

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+ G: S0 C$ {# i; T& K8 }  f' R0 _$ h& R
引物二聚体的出现不一定会出现在每次扩增和其它基因的扩增中，其跟引物的设计有关。个人认为，在基因扩增时，引物的都是过量的，如果两对引物直接有4个（含）以上的碱基配对，引物二聚体就常常会出现，在不影响基因扩增和表达趋势的情况下，可以忽略不计。通常使用时的引物浓度为10uM,如果引物二聚体较为明显，或者影响了扩增，可以适当降低引物浓度。另外，为了提高扩增效率和扩增时的特异性，可以提高退火温度。

云飘过的思念

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gxbzjznn 发表于 2016-1-13 22:38
( x0 o2 |1 T, k3 o9 A! w回复 nichifanlema2 的帖子& z, ~/ A0 d4 d: [% g

% H, \* t4 |# j/ ]我是按照引物合成回来以后引物管上标注的体积加对应的TE buffer溶解以后再用水 ...

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' d) x. j' d, Y  v4 [
我们之前溶解引物的方法如下，仅供参考
0 H! t- e+ u5 X8 M+ |! U: f实测浓度（ng/ul）=实测260值*33*稀释倍数# L& Y+ J* c* ]! U0 J. @2 ?9 u, S
实际浓度（uM）= 实测浓度（ng/ul）*1000/M.W
1 j- A& ?# m$ S& v$ V7 L补水量（ul）= 实际浓度（uM）*（总体积-测OD消耗体积）/定溶浓度（uM）- （总体积-测OD消耗体积）6 F4 U# v* N: L% o$ u1 t" H. s* u
7 q1 u+ @# G4 h# a; H& a
定量设备为NanoDorp2000

云飘过的思念

! J# G% C+ v+ o6 P4 G+ o; g, N
; n+ S6 u& c( }" ]1 q- M; v# J
回复 gxbzjznn 的帖子* O  r; _9 E" u/ P8 }
" W1 f& o* y8 `' s$ d
恩，具体染料可以分很多种，只要能在特定波长激发光下发光即可，但是染色方法是胶染哈，嘿嘿

gxbzjznn

回复 nichifanlema2 的帖子+ r2 j# X7 `. p. _. S, S! E
  }# b, i) \( Z  q
我是按照引物合成回来以后引物管上标注的体积加对应的TE buffer溶解以后再用水稀释十倍的 （取10ul到另一个新的1.5ml离心管再加90ul无酶水） ！  这样浓度还大的话该怎么稀释呢？你们一般都是怎么稀释引物呢？

gxbzjznn

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6 u% V7 f- S/ `. Y/ G# m
我们用核酸染料是Gelview

gxbzjznn

回复 king8 的帖子$ T2 o& i1 \, x) h8 y1 Q, {
8 f- I: [& M5 e
不可能是特异性扩增吧？因为片段差距很大啊 我的product length 是200bp  中间还有最下面的都在50bp以下  另外请问一下 你们设计引物的时候看Self complementarity 以及Self 3' complementarity的值么？他们跟TM值以及GC含量之间有冲突时该如何选择？有优先选择顺序码？谢谢

gxbzjznn

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% d; G5 p' q! u) M7 h2 h9 P9 @  B  w# n* s0 b% v9 W
Takara

gxbzjznn

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% c0 V; t8 Z% t7 c$ C& d  A6 c+ c' e/ y  x
不可能是特异性扩增吧？因为片段差距很大啊 我的product length 是200bp  中间还有最下面的都在50bp以下  另外请问一下 你们设计引物的时候看Self complementarity 以及Self 3' complementarity的值么？他们跟TM值以及GC含量之间有冲突时该如何选择？有优先选择顺序码？谢谢

gxbzjznn

回复 nichifanlema2 的帖子# ^9 n- D% Q; w# L7 I

; H% C; o+ `9 i我也觉得中间是引物二聚体 但是我做的其他基因就没有这种情况