胚胎干细胞培养标准操作规程(SOP)

风云动

一、细胞
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2 O1 j3 E/ f; N$ d 多能性胚胎干细胞产生于小鼠胚泡2 L( p( Q! g/ |  L

  g4 m2 R9 r' w( t, _ 1．表达绿色荧光蛋白（EGFP）的B5-ES细胞。由DrNgy的实室制备。
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2．D3-ATCC;CRL-1934我们得到时大约传了17代。
) U8 c: I  [  ]7 K/ `+ X9 u4 K: o2 E( W
3．J1-由DrJenish的实室友情提供。我们得到时大约传了7－9代。  C+ P7 q: K% a' C& Q
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4．J1rtTA-rtTA表达J1细胞，由DrJenish的实室友情提供。
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5．表达黄色荧光蛋白的YC5-ES细胞，由DrNgy的实室提供。
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二、一般培养--维持ES细胞处于未分化状态0 d  ?. N$ e! K/ C* W

, n8 _% G6 L; b; P ES细胞培养用含有ESGRO（白血病抑制因子）的高糖培养基来阻止细胞的分化。为细胞提供包被有01％明胶的平板作为粘附细胞的基质。建议每2－3天从达到80％－90％融合的平板按1：8的比率传代细胞一次，细胞传代以后，在将细胞接种在01％明胶包被的培养皿之前，通过预先将细胞接种在没有经过包被的组织培养板2个小时，使分化细胞粘附，从而将分化和未分化细胞分开。将细胞全程置于37℃，5％CO2，100％湿度条件下培养。1 @8 N+ @0 ~) O% w( L* U+ S

" ~1 b% T) [; D' p& _/ y2 D4 X" t 培养基
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ES：配制一20×不含DMEM，HS，ESGRO的溶液（该溶液也能用于EB培养基--见下文）。分装在50FALCON管中，（稀释为2×，每管42），贮存在-20℃。通过将21该溶液，HS和ESGRO加入450DMEM中制备培养基，02靘滤膜过滤。贮存于4℃。注：一瓶DMEM是500。
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贮存液
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DMEM(高糖)
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) t) o+ C/ S$ G2 G: c 马血清（HS）
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L-谷氨酰胺（200M）; b$ ^/ D1 z' W* F/ S" V

# Y" c8 k* m& v6 F, N MEMNEAA（10M）2 {3 {$ F$ i( q3 u( n4 @7 [

, [' g5 H* B+ S! V% G; ^  s( D; b. [ HEPES（1M）
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?-巯基乙醇（55M）
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PEST
% Q: l& w. T3 h" H+ g, ^/ Y' \# U( a& X
ESGRO
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复苏细胞
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细胞被冻存在10％二甲基亚砜（DMSO）中防止结晶的形成，结晶的形成会损害细胞。然而，二甲基亚砜对细胞有毒性，快速的进行细胞复苏是很重要的。
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步骤: c" J( j; H' f, j5 c6 }

! L' U( X; E- U1 u 1．从液氮中取出一管细胞；
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2．将冻存管置于37℃水浴中2分钟（或放到管内溶液恰好完全溶解）；0 m7 z7 o, z, s  D8 l. F" A
% e. n; e$ F: ?# X4 c
3．将细胞转移到一15Fn管中；2 ~3 ^; i+ K/ N3 R8 K. P" M* t

% @! L7 k/ G# @ 4．加入5ES培养基（用培养基冲洗冻存管）；, u* P% ~* d+ J( ^) k! E8 U
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5．离心3分钟；1 n' i9 a1 [/ a
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6．弃上清，用2ES培养基重悬细胞，至少吹打10次；
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7．接种在明胶包被（见下文）的6孔或6组织培养皿；
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4 d2 \/ `6 v% b5 G7 ] 8．孵育。