胚胎干细胞培养标准操作规程(SOP)

风云动

一、细胞
- Q4 i" \$ {) f0 _$ b- Z
! F6 ?# o: U; d: z+ A 多能性胚胎干细胞产生于小鼠胚泡9 @' w9 b9 L" P5 R& O

( F; ^& ^+ T( b$ x 1．表达绿色荧光蛋白（EGFP）的B5-ES细胞。由DrNgy的实室制备。
3 \4 J$ O1 Z2 B- @" Q
. U9 {8 d# k) ~- x% K/ { 2．D3-ATCC;CRL-1934我们得到时大约传了17代。
2 e% n7 I9 z$ A+ R3 h, @. |
; l& J$ `; W3 f/ }$ Q9 V4 t$ S 3．J1-由DrJenish的实室友情提供。我们得到时大约传了7－9代。
( T: \, }9 t7 C7 A7 u9 V( P3 e8 {
  k4 l) }" [% ?1 b* ~: R( \0 f3 j 4．J1rtTA-rtTA表达J1细胞，由DrJenish的实室友情提供。+ `/ P2 x# |5 a& p7 H
, P( }1 [) q4 _) {$ X6 n! {4 V& X
5．表达黄色荧光蛋白的YC5-ES细胞，由DrNgy的实室提供。
( X+ @( b) `, w; K# E( f. a0 E$ s! R5 o. q
二、一般培养--维持ES细胞处于未分化状态  `8 f# J7 Q2 b5 k6 \7 v" Q$ K

. a- O7 b" o) P- Q0 i5 y: c/ ^ ES细胞培养用含有ESGRO（白血病抑制因子）的高糖培养基来阻止细胞的分化。为细胞提供包被有01％明胶的平板作为粘附细胞的基质。建议每2－3天从达到80％－90％融合的平板按1：8的比率传代细胞一次，细胞传代以后，在将细胞接种在01％明胶包被的培养皿之前，通过预先将细胞接种在没有经过包被的组织培养板2个小时，使分化细胞粘附，从而将分化和未分化细胞分开。将细胞全程置于37℃，5％CO2，100％湿度条件下培养。) {7 M: `4 n/ J2 m8 X
; j2 j/ e5 W. l$ j
培养基
1 f" O! l  m6 b* H4 F# b
* U2 U6 N% B( _0 M" k$ I3 G0 Y ES：配制一20×不含DMEM，HS，ESGRO的溶液（该溶液也能用于EB培养基--见下文）。分装在50FALCON管中，（稀释为2×，每管42），贮存在-20℃。通过将21该溶液，HS和ESGRO加入450DMEM中制备培养基，02靘滤膜过滤。贮存于4℃。注：一瓶DMEM是500。
2 _3 K4 X7 N5 ~( J# F6 h: \# J3 P( g0 n( f( A0 G! b+ R9 Y' F
贮存液
) h/ R- c* `+ o$ I: T' I! N. V1 [7 X4 T  }) g3 S' |% N1 N
DMEM(高糖)3 d' u! T: M# L. R( i3 w% h* S
- j, l+ F. s0 p& P
马血清（HS）
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L-谷氨酰胺（200M）+ o4 G/ k: d& M7 |, a: b5 v

' W& \- C7 S; }* @% C" E MEMNEAA（10M）
2 Y. i* ~  l9 G8 K, p& ?
) V# \* K( ]0 ^5 h8 P( _9 j HEPES（1M）" l6 o3 h/ ~7 f: S2 ^( P  u! J; }, [- V

! W) s1 u1 H  M4 V: L ?-巯基乙醇（55M）& P3 r' ?# D  T* E8 l

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: A* F2 t4 `8 v# F9 Z' k9 m1 M6 u$ `* P/ T
ESGRO1 X: @6 n2 Z$ ^$ Y# c

8 i8 I' b, D- g0 _2 u6 u$ m  b* y 复苏细胞
: y  S0 U# c1 U  x: f
! B2 ^" W$ p" e; {$ q+ } 细胞被冻存在10％二甲基亚砜（DMSO）中防止结晶的形成，结晶的形成会损害细胞。然而，二甲基亚砜对细胞有毒性，快速的进行细胞复苏是很重要的。, d  v( q, _, m: O

) P1 Z& ^# X( W, u# w. G8 Q  K& J 步骤/ L1 F3 j2 @, W
) X7 h0 r$ {! j, u( j! |
1．从液氮中取出一管细胞；5 U/ d' ~* e% F8 Q

# b8 m1 q0 x% d4 y0 w' H6 L 2．将冻存管置于37℃水浴中2分钟（或放到管内溶液恰好完全溶解）；! ~; o( O- F. b1 A
0 C& k& c( h* J3 Y( u" j: c
3．将细胞转移到一15Fn管中；
1 R- J( B: j4 W1 ^; {: n4 N- @, S0 \. R; `7 w
4．加入5ES培养基（用培养基冲洗冻存管）；; R1 ~: \* @6 `% r) j8 c
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5．离心3分钟；* l2 L0 L% D4 ?) Z, [: n
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6．弃上清，用2ES培养基重悬细胞，至少吹打10次；
* D' u( Q/ k8 V+ {' i  z# S. X6 A2 r
7．接种在明胶包被（见下文）的6孔或6组织培养皿；
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8．孵育。