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本帖最后由 细胞海洋 于 2016-2-16 09:55 编辑
) l: k7 p, N$ P) I! A7 [9 E$ l' Y$ c: l# `1 {
1 目的：保证Car-T细胞制备和培养符合要求。
9 o6 | g8 k( b1 k2 范围：适用于符合实验的要求患者外周血制备和培养* ?) x1 {# t$ k' K% J2 W" p3 H6 I
3 责任人：实验员人、临床相关人员。 T. v6 Y) O3 K8 I Z! N5 i
4 内容: R# _. [* F" Z
4.1耗材：50ml离心管，10ml移液管，5ml移液管，75cm2培养瓶，150 cm2培养瓶，EP管，1.8ml冻存管: G/ R" ~( E' R8 ^' O1 }
4.2试剂：X-VIVO 15TM，PBS缓冲液，75%医用酒精，人淋巴细胞分离液，CD3/CD28免疫磁珠，IL-2，注射用人血白蛋白。- g) F2 S% G) e8 O
4.3环境：& {: u( w. J A2 M3 J
4.3.1外周血分离，培养应在恒温恒湿的万级层流室内进行，开放操作必须在百级生物安全柜内进行。
8 x' c$ ~; n8 I. H4.3.2实验人员应提前对净化室和生物安全柜进行杀菌消毒，紫外线照射时间不少于30min，消毒消毒后，净化空调开启时间不少于30min，生物安全柜运行稳定后方可操作。
) \7 h/ v' d( @# u! e8 Q4 n4.4操作：
4 z6 X8 d6 E$ C6 K$ M+ G; w4.4.1采集接收外周血) |* W' Z k7 w. Y0 t# C" E
4.4.1.1患者符合治疗方案，各项检测符合要求，采集患者外周血60-80ml。& H0 r# M2 U0 X. a5 b$ g( ]
4.4.1.2接收外周血并填写《外周血采集交接记录》，核对外周血患者相关信息，及相应检测报告，报告由医院提供，至少包括：HBsAg，HCVAb，HIVAb，Anti-TP，ALT。# N6 W$ h; s8 O# I
4.4.2操作前准备+ W+ y9 N/ {; z; U" S. U
4.4.2.1净化室，生物安全柜消毒完毕后，开启净化空调运行30min，生物安全柜运行稳定。
* J, S+ R# @; g) f4.4.2.2从试剂间冰箱中取出细胞培养基，恢复室温。
1 P" [/ ?- ] \- m% A) T$ _' C4.4.2.3生物安全柜表面75%酒精消毒，外周血袋表面酒精消毒转入安全柜内。
" a' Q# f7 ?( z% `% x3 Y$ a, |4.4.3 分离单个核细胞（PBMC）：/ A7 Q# o) \2 K, C8 v
4.4.3.1使用灭菌消毒的剪刀剪断血袋塑料管或者使用一次性注射器，把血袋内外周血转入50ml离心管中。
3 w' S8 F. u3 Q6 p9 E/ L: c' r4.4.3.2用PBS缓冲液按1:1稀释外周血，混匀。
( O% I% j; t, g% j2 h) B4.4.3.3将稀释好的血样缓慢加入室温的15ml人淋巴细胞分离液的离心管中。方法如下：用10ml移液管吸取血样，伸至分离液液面上方0.5cm处，血样自然滑落铺至分离液面上，然后轻轻加入血样，注意不要冲破液面。* H0 w" z0 X8 A$ a
4.4.3.4配平离心1200g（2100r/min）离心20min，慢升慢降。
& C: z, }1 B5 u) e" v$ k4.4.3.5离心完成后，离心管出现明显分层由下至上：红细胞层，粒细胞层，Ficoll层，单个核细胞层和血浆层。吸取血浆层至距白膜层5mm左右处弃之。小心吸取红细胞层以上的所有液体至离心管中，PBS稀释，与细胞悬液体积比应大于1:3，混匀。8 a, Y9 e" Q9 x" x% w+ Z' S7 W4 y3 h
4.4.3.6离心600g（1600r/min）5min，PBS重悬细胞混匀，取少量细胞计数。3 u+ x7 _; {) t: S' }* M. v) u. V
4.4.3.7离心300g（1200r/min）5min，上清液送检无菌检测。. G( Y, [+ s! Z
4.4.4细胞培养：
$ B8 N$ B+ Q4 r, }- y4.4.4.1细胞培养条件：恒温37℃，CO2浓度 5%，相对饱和湿度95%，细胞培养基PH值7.2-7.4。3 `! e9 f) O, p) d+ ?# @
4.4.4.2根据细胞计数调密度2x106/ml加入培养瓶中（T150 200x106/100ml, T75 100x106/50ml ,T25 50x106/25ml）。混匀放入CO2培养箱培养2小时。* Q! ?, E/ J7 \ Q
4.4.4.3取出培养瓶，轻摇，使沉降于底部的悬浮细胞浮起，培养瓶倾斜30度角，移液管吸取培养基转入离心管中，少些培养基洗培养瓶将悬浮细胞全部收集，混匀计数。: x' q$ U+ Q# T- Z) w; V
4.4.4.4根据细胞计数调整细胞浓度1.2x106/ml接种培养瓶中（100-120ml in a T150，50-60ml in a T75，15-29ml in a T25），加CD3/CD28磁珠，按细胞与磁珠比例为1:3（加之前磁珠用培养基洗涤3次，去除保存液），加入IL-2 100U/ml，混匀放入CO2培养箱培养。
. L, _, X, E# ?3 \ `6 }7 M: \+ Q0 \4.4.4.5次日细胞培养1天，调整细胞密度至0.6x106/ml，加入病毒（MOI为1-5）混匀放入CO2培养箱培养。
2 \# W9 P5 R \/ t) F" ~. @4.4.4.6细胞培养3天，细胞计数补加培养基，IL-2 100U/ml细胞密度调整至0.6x106/ml继续培养。+ F. U4 o) B/ L) W: T; P! a9 d
4.4.4.7细胞培养5天去磁珠，细胞混匀转离心管中，在磁力架上去除磁珠，细胞计数补加培养基，IL-2 100U/ml细胞密度调整至0.6x106/ml继续培养。( `) ?& V/ @" b
4.4.4.8定期观察细胞生长情况，主要观察其形态的变化，数目及增值情况，细胞碎片及杂质情况，每2-3天加液培养。
$ j {' Q7 T8 |7 y( n4.4.4.9根据细胞状态和临床治疗需要，培养9天时细胞数量达到要求，各项检测合格。包括：无菌检测，内毒素检测，细胞活力，细胞表型等。1 }' Y- p8 q. J
4.4.5 Car-T细胞收集：! y1 }2 R! A/ {+ l2 q6 [
4.4.5.1确认细胞各项检测己符合要求。
; h0 e1 I: k% D m; n$ {4.4.5.2根据治疗方案（一般一个疗程分多次回输，间隔时间为1天），取出相应细胞悬液，剩余细胞补加培养基继续培养，供再次回输。8 F. G) y1 Z0 m% E
4.4.5.3细胞悬液转入离心管中，300g离心5min。
! f1 t) H3 p' c5 l' a2 @4.4.5.4除去上清培养液，加PBS缓冲液稀释混匀，300g离心5min，弃上清，PBS缓冲液300g/min离心5min。; w' ?( t4 u& j; ]
4.4.5.5细胞装袋（一般静脉回输，采用100ml双阀盐水袋），离心完成后取上清，做无菌检测，20ml生理盐水重悬细胞，100μm细胞滤网过滤，取少量细胞悬液进行细胞数量，细胞活率，革兰氏检测，内毒素检测。细胞过滤完成，转入100ml盐水袋中，加5%注射用人血白蛋白，贴上标签，并填写相关记录。0 v: T8 i" ~! V+ Z. U+ d
4.5细胞运输与保存：
( ^& [, L. x! b. L$ W4.5.1核对细胞标签内容，填写回输发放记录。
- {" L* H, I. {; w4.5.2细胞盐水袋放置于运输容器内（一般为疫苗箱，4度），填写交接记录表。
. [' k# C9 J1 z# _4 u* M4.5.3运输人员在运输过程中避免距离震荡，并在规定时间内送到。
% }6 b }3 j) K# u+ `. b4.5.4细胞运输保存温度保持在4度左右，并在规定时间内回输，如果患者不能按时回输，请及时联系实验技术人员，返回实验室。
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发表于 2016-2-16 09:29
