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本帖最后由 细胞海洋 于 2016-2-16 09:55 编辑
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% C0 t" j7 a$ Q5 r+ U1 目的：保证Car-T细胞制备和培养符合要求。: f5 b+ v# H0 @4 `# b3 T: `+ Q
2 范围：适用于符合实验的要求患者外周血制备和培养
; `3 k& }4 o) n, o3 责任人：实验员人、临床相关人员。9 |4 F: l/ o( r9 ~3 j
4 内容
. T- V" b. T7 L! ~- M4.1耗材：50ml离心管，10ml移液管，5ml移液管，75cm2培养瓶，150 cm2培养瓶，EP管，1.8ml冻存管4 j4 E* P) c% T; [- K
4.2试剂：X-VIVO 15TM，PBS缓冲液，75%医用酒精，人淋巴细胞分离液，CD3/CD28免疫磁珠，IL-2，注射用人血白蛋白。. W" t M9 v9 R
4.3环境：! J. _) N% q# B* \* m$ o0 V
4.3.1外周血分离，培养应在恒温恒湿的万级层流室内进行，开放操作必须在百级生物安全柜内进行。
$ R( M: z6 B! Q8 F( M5 ]3 o4 u4.3.2实验人员应提前对净化室和生物安全柜进行杀菌消毒，紫外线照射时间不少于30min，消毒消毒后，净化空调开启时间不少于30min，生物安全柜运行稳定后方可操作。7 W& X7 U- G( [( o5 {
4.4操作：( N1 i8 L* R: D8 m9 l# ^
4.4.1采集接收外周血; i4 m" c( c M0 h
4.4.1.1患者符合治疗方案，各项检测符合要求，采集患者外周血60-80ml。& L* w# B1 v4 W$ J* B* e5 y
4.4.1.2接收外周血并填写《外周血采集交接记录》，核对外周血患者相关信息，及相应检测报告，报告由医院提供，至少包括：HBsAg，HCVAb，HIVAb，Anti-TP，ALT。
+ d, @' C3 d. b$ G7 q; g O4.4.2操作前准备
- z- G4 G5 Z ^/ w3 S& ^4.4.2.1净化室，生物安全柜消毒完毕后，开启净化空调运行30min，生物安全柜运行稳定。
) N7 `; A& _) [% A& V+ k) P; a4.4.2.2从试剂间冰箱中取出细胞培养基，恢复室温。0 Q+ c- C! F2 B) x
4.4.2.3生物安全柜表面75%酒精消毒，外周血袋表面酒精消毒转入安全柜内。" i7 S4 O* u0 k$ _: c
4.4.3 分离单个核细胞（PBMC）：6 s/ o# a2 d( S) L( F
4.4.3.1使用灭菌消毒的剪刀剪断血袋塑料管或者使用一次性注射器，把血袋内外周血转入50ml离心管中。
% A. Z7 U- W/ z2 N/ M. q4.4.3.2用PBS缓冲液按1:1稀释外周血，混匀。
* x) r! B' p) w) _0 I4.4.3.3将稀释好的血样缓慢加入室温的15ml人淋巴细胞分离液的离心管中。方法如下：用10ml移液管吸取血样，伸至分离液液面上方0.5cm处，血样自然滑落铺至分离液面上，然后轻轻加入血样，注意不要冲破液面。" [# @! n- U1 }1 Q7 _5 F
4.4.3.4配平离心1200g（2100r/min）离心20min，慢升慢降。
- r. i9 V7 p7 J4 H, F4.4.3.5离心完成后，离心管出现明显分层由下至上：红细胞层，粒细胞层，Ficoll层，单个核细胞层和血浆层。吸取血浆层至距白膜层5mm左右处弃之。小心吸取红细胞层以上的所有液体至离心管中，PBS稀释，与细胞悬液体积比应大于1:3，混匀。
8 P- u) I7 a( o- f; I0 i* _4.4.3.6离心600g（1600r/min）5min，PBS重悬细胞混匀，取少量细胞计数。
( t0 B4 K* e0 @: J4.4.3.7离心300g（1200r/min）5min，上清液送检无菌检测。
! N/ ~3 J8 d, Z! V' ~' X' ?4.4.4细胞培养：
/ Z$ b: l/ p% v' `4.4.4.1细胞培养条件：恒温37℃，CO2浓度 5%，相对饱和湿度95%，细胞培养基PH值7.2-7.4。% S8 k; M2 _# ?( \
4.4.4.2根据细胞计数调密度2x106/ml加入培养瓶中（T150 200x106/100ml, T75 100x106/50ml ,T25 50x106/25ml）。混匀放入CO2培养箱培养2小时。
; R1 c8 z: x( p# F4.4.4.3取出培养瓶，轻摇，使沉降于底部的悬浮细胞浮起，培养瓶倾斜30度角，移液管吸取培养基转入离心管中，少些培养基洗培养瓶将悬浮细胞全部收集，混匀计数。! A1 r2 F! J7 G9 y; D6 S( ?) {
4.4.4.4根据细胞计数调整细胞浓度1.2x106/ml接种培养瓶中（100-120ml in a T150，50-60ml in a T75，15-29ml in a T25），加CD3/CD28磁珠，按细胞与磁珠比例为1:3（加之前磁珠用培养基洗涤3次，去除保存液），加入IL-2 100U/ml，混匀放入CO2培养箱培养。 X8 y& G E1 }# ?5 G; @$ Z
4.4.4.5次日细胞培养1天，调整细胞密度至0.6x106/ml，加入病毒（MOI为1-5）混匀放入CO2培养箱培养。
( a" R4 r( h, l4 `4.4.4.6细胞培养3天，细胞计数补加培养基，IL-2 100U/ml细胞密度调整至0.6x106/ml继续培养。5 }, K$ h ^4 p) J
4.4.4.7细胞培养5天去磁珠，细胞混匀转离心管中，在磁力架上去除磁珠，细胞计数补加培养基，IL-2 100U/ml细胞密度调整至0.6x106/ml继续培养。8 |0 v! K! p* b
4.4.4.8定期观察细胞生长情况，主要观察其形态的变化，数目及增值情况，细胞碎片及杂质情况，每2-3天加液培养。: X, m* y- ^8 D0 a+ z
4.4.4.9根据细胞状态和临床治疗需要，培养9天时细胞数量达到要求，各项检测合格。包括：无菌检测，内毒素检测，细胞活力，细胞表型等。% ^) {! @- Z& W3 i I( e
4.4.5 Car-T细胞收集：
% Z* A5 ]8 p! }* x* q/ E: Z' r2 A4.4.5.1确认细胞各项检测己符合要求。8 U+ Q' O: \# [$ t! k U: z2 H
4.4.5.2根据治疗方案（一般一个疗程分多次回输，间隔时间为1天），取出相应细胞悬液，剩余细胞补加培养基继续培养，供再次回输。4 m/ B* `- J- W# |4 ]
4.4.5.3细胞悬液转入离心管中，300g离心5min。
( D2 r N% q l6 e+ f4.4.5.4除去上清培养液，加PBS缓冲液稀释混匀，300g离心5min，弃上清，PBS缓冲液300g/min离心5min。3 C+ M# E5 h( {9 V
4.4.5.5细胞装袋（一般静脉回输，采用100ml双阀盐水袋），离心完成后取上清，做无菌检测，20ml生理盐水重悬细胞，100μm细胞滤网过滤，取少量细胞悬液进行细胞数量，细胞活率，革兰氏检测，内毒素检测。细胞过滤完成，转入100ml盐水袋中，加5%注射用人血白蛋白，贴上标签，并填写相关记录。9 v# |& {* V+ o E2 E% a
4.5细胞运输与保存：
3 E( @( P3 J2 ?4.5.1核对细胞标签内容，填写回输发放记录。
: |% Z) M( d4 L8 n/ n4.5.2细胞盐水袋放置于运输容器内（一般为疫苗箱，4度），填写交接记录表。
8 {8 R. _" D- D4 ^4.5.3运输人员在运输过程中避免距离震荡，并在规定时间内送到。
- V9 N" i& A" u+ c% J4 M3 a: o7 N4.5.4细胞运输保存温度保持在4度左右，并在规定时间内回输，如果患者不能按时回输，请及时联系实验技术人员，返回实验室。
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发表于 2016-2-16 09:29
