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本帖最后由 细胞海洋 于 2016-2-16 09:55 编辑
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1 目的：保证Car-T细胞制备和培养符合要求。
$ {) N8 B) `/ U* L! c2 范围：适用于符合实验的要求患者外周血制备和培养
: D( z" [" w( n/ {) X$ o8 |1 q3 责任人：实验员人、临床相关人员。
4 _ c$ \( z6 s" k4 内容$ G; z$ x/ H' D4 o3 E
4.1耗材：50ml离心管，10ml移液管，5ml移液管，75cm2培养瓶，150 cm2培养瓶，EP管，1.8ml冻存管* ~: g3 t j& K7 v" p$ l$ q
4.2试剂：X-VIVO 15TM，PBS缓冲液，75%医用酒精，人淋巴细胞分离液，CD3/CD28免疫磁珠，IL-2，注射用人血白蛋白。
! F' s5 E; y: `' X6 R4 r4.3环境：
! N6 p+ ?( Z9 S6 |% a% u4.3.1外周血分离，培养应在恒温恒湿的万级层流室内进行，开放操作必须在百级生物安全柜内进行。9 b3 w& Y; x' B4 Z
4.3.2实验人员应提前对净化室和生物安全柜进行杀菌消毒，紫外线照射时间不少于30min，消毒消毒后，净化空调开启时间不少于30min，生物安全柜运行稳定后方可操作。
) z. V! B7 x/ W1 k/ r/ S% o4.4操作：
5 W7 A' m! c. ?/ H4.4.1采集接收外周血/ J4 n: g& V' i! s! y
4.4.1.1患者符合治疗方案，各项检测符合要求，采集患者外周血60-80ml。
1 d' o. v2 r4 |4.4.1.2接收外周血并填写《外周血采集交接记录》，核对外周血患者相关信息，及相应检测报告，报告由医院提供，至少包括：HBsAg，HCVAb，HIVAb，Anti-TP，ALT。
f, ~, U6 g; f4 p) _4.4.2操作前准备8 c) D9 a2 ~2 a- [( [
4.4.2.1净化室，生物安全柜消毒完毕后，开启净化空调运行30min，生物安全柜运行稳定。
5 k0 {$ {' \ Z, [4 W6 ?$ p4.4.2.2从试剂间冰箱中取出细胞培养基，恢复室温。1 F) u# i! l! j; A3 m: r
4.4.2.3生物安全柜表面75%酒精消毒，外周血袋表面酒精消毒转入安全柜内。
, ]( ~2 ?+ L& @9 `7 l y W4.4.3 分离单个核细胞（PBMC）：
2 {, G' j% y( K' f4.4.3.1使用灭菌消毒的剪刀剪断血袋塑料管或者使用一次性注射器，把血袋内外周血转入50ml离心管中。
( l* p( ~0 q0 J6 \, ]% F4.4.3.2用PBS缓冲液按1:1稀释外周血，混匀。( X6 r! F ~3 g/ J$ V5 F
4.4.3.3将稀释好的血样缓慢加入室温的15ml人淋巴细胞分离液的离心管中。方法如下：用10ml移液管吸取血样，伸至分离液液面上方0.5cm处，血样自然滑落铺至分离液面上，然后轻轻加入血样，注意不要冲破液面。 `1 ?. U. X6 i5 `
4.4.3.4配平离心1200g（2100r/min）离心20min，慢升慢降。
6 T9 Q7 o' D. A% @7 D+ K: f4.4.3.5离心完成后，离心管出现明显分层由下至上：红细胞层，粒细胞层，Ficoll层，单个核细胞层和血浆层。吸取血浆层至距白膜层5mm左右处弃之。小心吸取红细胞层以上的所有液体至离心管中，PBS稀释，与细胞悬液体积比应大于1:3，混匀。
) ?7 m- f5 U4 B& I. F9 T( x4.4.3.6离心600g（1600r/min）5min，PBS重悬细胞混匀，取少量细胞计数。! q: m1 `9 Z3 Z, I
4.4.3.7离心300g（1200r/min）5min，上清液送检无菌检测。
( l. u% D( v3 i1 z0 v- Y4.4.4细胞培养：% k0 Z: V; T3 J* ?. l4 h9 h, N8 C
4.4.4.1细胞培养条件：恒温37℃，CO2浓度 5%，相对饱和湿度95%，细胞培养基PH值7.2-7.4。
p/ F% {5 e( w! Y' h# U4.4.4.2根据细胞计数调密度2x106/ml加入培养瓶中（T150 200x106/100ml, T75 100x106/50ml ,T25 50x106/25ml）。混匀放入CO2培养箱培养2小时。
% j& D; S- w) I+ [4.4.4.3取出培养瓶，轻摇，使沉降于底部的悬浮细胞浮起，培养瓶倾斜30度角，移液管吸取培养基转入离心管中，少些培养基洗培养瓶将悬浮细胞全部收集，混匀计数。
[ \# d/ t% M& L! f C/ U6 I4.4.4.4根据细胞计数调整细胞浓度1.2x106/ml接种培养瓶中（100-120ml in a T150，50-60ml in a T75，15-29ml in a T25），加CD3/CD28磁珠，按细胞与磁珠比例为1:3（加之前磁珠用培养基洗涤3次，去除保存液），加入IL-2 100U/ml，混匀放入CO2培养箱培养。: }, _" P# s' F+ V
4.4.4.5次日细胞培养1天，调整细胞密度至0.6x106/ml，加入病毒（MOI为1-5）混匀放入CO2培养箱培养。5 m1 D A( K9 F8 x
4.4.4.6细胞培养3天，细胞计数补加培养基，IL-2 100U/ml细胞密度调整至0.6x106/ml继续培养。0 z$ G- M! v4 L0 x. J: L
4.4.4.7细胞培养5天去磁珠，细胞混匀转离心管中，在磁力架上去除磁珠，细胞计数补加培养基，IL-2 100U/ml细胞密度调整至0.6x106/ml继续培养。
( s. V$ Y. Q, K7 a4 x4.4.4.8定期观察细胞生长情况，主要观察其形态的变化，数目及增值情况，细胞碎片及杂质情况，每2-3天加液培养。
7 {, C4 A* f$ o, L* j4.4.4.9根据细胞状态和临床治疗需要，培养9天时细胞数量达到要求，各项检测合格。包括：无菌检测，内毒素检测，细胞活力，细胞表型等。8 I3 F8 l' @9 _
4.4.5 Car-T细胞收集：
7 c7 d4 X$ X; d! ]2 l4.4.5.1确认细胞各项检测己符合要求。
# h* F% ^/ j$ |0 ^7 z1 X+ U5 Q! c. V4.4.5.2根据治疗方案（一般一个疗程分多次回输，间隔时间为1天），取出相应细胞悬液，剩余细胞补加培养基继续培养，供再次回输。
: \( s: g4 e1 c7 m8 w6 j4.4.5.3细胞悬液转入离心管中，300g离心5min。
9 I D6 M5 G! E7 R% ^, o5 k y4.4.5.4除去上清培养液，加PBS缓冲液稀释混匀，300g离心5min，弃上清，PBS缓冲液300g/min离心5min。
- X) `' Q# c" N" o% \4.4.5.5细胞装袋（一般静脉回输，采用100ml双阀盐水袋），离心完成后取上清，做无菌检测，20ml生理盐水重悬细胞，100μm细胞滤网过滤，取少量细胞悬液进行细胞数量，细胞活率，革兰氏检测，内毒素检测。细胞过滤完成，转入100ml盐水袋中，加5%注射用人血白蛋白，贴上标签，并填写相关记录。; v% z% a9 z/ h
4.5细胞运输与保存：. b3 u' |% z/ H4 ~ a
4.5.1核对细胞标签内容，填写回输发放记录。6 F+ d& z4 @9 u' \/ Q
4.5.2细胞盐水袋放置于运输容器内（一般为疫苗箱，4度），填写交接记录表。
4 V# }. L8 V9 y% I' \) [4.5.3运输人员在运输过程中避免距离震荡，并在规定时间内送到。
9 ~; z6 H0 l# x9 x6 A, K# t/ D$ F2 F# P4.5.4细胞运输保存温度保持在4度左右，并在规定时间内回输，如果患者不能按时回输，请及时联系实验技术人员，返回实验室。
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发表于 2016-2-16 09:29
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