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本帖最后由 细胞海洋 于 2016-2-16 09:55 编辑 6 b4 Q' p& @7 h! Y+ [* @% F
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1 目的：保证Car-T细胞制备和培养符合要求。# C' u* v8 E& p; {% K# N8 g. X" g# s
2 范围：适用于符合实验的要求患者外周血制备和培养" D2 _! F3 D4 I7 C+ q
3 责任人：实验员人、临床相关人员。7 g8 o5 N" V' m2 Y& b
4 内容' R* I: H. G/ H
4.1耗材：50ml离心管，10ml移液管，5ml移液管，75cm2培养瓶，150 cm2培养瓶，EP管，1.8ml冻存管
; u# F7 ?% u3 b% a( |4.2试剂：X-VIVO 15TM，PBS缓冲液，75%医用酒精，人淋巴细胞分离液，CD3/CD28免疫磁珠，IL-2，注射用人血白蛋白。
8 s/ [8 @3 @; y5 q4.3环境：! e8 E* Q, g7 t' m% j
4.3.1外周血分离，培养应在恒温恒湿的万级层流室内进行，开放操作必须在百级生物安全柜内进行。* {' o* {: l4 t+ W+ q% E
4.3.2实验人员应提前对净化室和生物安全柜进行杀菌消毒，紫外线照射时间不少于30min，消毒消毒后，净化空调开启时间不少于30min，生物安全柜运行稳定后方可操作。
' t' d1 O* M! `5 E) D7 W4.4操作：/ u1 r" h6 x6 `
4.4.1采集接收外周血
4 w2 {0 w | l4 A4.4.1.1患者符合治疗方案，各项检测符合要求，采集患者外周血60-80ml。5 K6 J0 H/ [4 ~3 v# M
4.4.1.2接收外周血并填写《外周血采集交接记录》，核对外周血患者相关信息，及相应检测报告，报告由医院提供，至少包括：HBsAg，HCVAb，HIVAb，Anti-TP，ALT。! G- k& U8 B9 E: H0 e
4.4.2操作前准备9 o z8 \. T" ?' `6 K9 k
4.4.2.1净化室，生物安全柜消毒完毕后，开启净化空调运行30min，生物安全柜运行稳定。" D% Y; C" n" `% K8 A
4.4.2.2从试剂间冰箱中取出细胞培养基，恢复室温。9 I/ D, X# L' R- P, x% N; V! E% m9 p1 a
4.4.2.3生物安全柜表面75%酒精消毒，外周血袋表面酒精消毒转入安全柜内。
# j( I: w! [1 O4.4.3 分离单个核细胞（PBMC）：- z. p9 w) `. D
4.4.3.1使用灭菌消毒的剪刀剪断血袋塑料管或者使用一次性注射器，把血袋内外周血转入50ml离心管中。; X% J" f1 x5 p6 b
4.4.3.2用PBS缓冲液按1:1稀释外周血，混匀。
5 P5 v4 |# i- }4.4.3.3将稀释好的血样缓慢加入室温的15ml人淋巴细胞分离液的离心管中。方法如下：用10ml移液管吸取血样，伸至分离液液面上方0.5cm处，血样自然滑落铺至分离液面上，然后轻轻加入血样，注意不要冲破液面。
: T& F3 z2 U& c$ D" |" \! }4.4.3.4配平离心1200g（2100r/min）离心20min，慢升慢降。$ L& t' Y2 Q, I
4.4.3.5离心完成后，离心管出现明显分层由下至上：红细胞层，粒细胞层，Ficoll层，单个核细胞层和血浆层。吸取血浆层至距白膜层5mm左右处弃之。小心吸取红细胞层以上的所有液体至离心管中，PBS稀释，与细胞悬液体积比应大于1:3，混匀。7 Y2 {2 j. W: K0 Q
4.4.3.6离心600g（1600r/min）5min，PBS重悬细胞混匀，取少量细胞计数。
% t- q7 g4 t: p) P4 h4.4.3.7离心300g（1200r/min）5min，上清液送检无菌检测。
% M: Z$ p) A L4 X i9 R$ j4.4.4细胞培养：
& _7 M8 W4 Y4 p6 A4.4.4.1细胞培养条件：恒温37℃，CO2浓度 5%，相对饱和湿度95%，细胞培养基PH值7.2-7.4。
! f) }; O* N8 _& u. W. l0 L, K4.4.4.2根据细胞计数调密度2x106/ml加入培养瓶中（T150 200x106/100ml, T75 100x106/50ml ,T25 50x106/25ml）。混匀放入CO2培养箱培养2小时。
. H" z8 ~" v1 y* T4 M4.4.4.3取出培养瓶，轻摇，使沉降于底部的悬浮细胞浮起，培养瓶倾斜30度角，移液管吸取培养基转入离心管中，少些培养基洗培养瓶将悬浮细胞全部收集，混匀计数。
5 w: H- p3 }! v. e" f: [5 \4.4.4.4根据细胞计数调整细胞浓度1.2x106/ml接种培养瓶中（100-120ml in a T150，50-60ml in a T75，15-29ml in a T25），加CD3/CD28磁珠，按细胞与磁珠比例为1:3（加之前磁珠用培养基洗涤3次，去除保存液），加入IL-2 100U/ml，混匀放入CO2培养箱培养。
" }+ z3 y$ s o6 X, `( I/ S; e4.4.4.5次日细胞培养1天，调整细胞密度至0.6x106/ml，加入病毒（MOI为1-5）混匀放入CO2培养箱培养。
& h4 |# ^/ L7 r4.4.4.6细胞培养3天，细胞计数补加培养基，IL-2 100U/ml细胞密度调整至0.6x106/ml继续培养。
/ M) ^5 D" Q+ k3 i+ M: u6 R) X9 S4.4.4.7细胞培养5天去磁珠，细胞混匀转离心管中，在磁力架上去除磁珠，细胞计数补加培养基，IL-2 100U/ml细胞密度调整至0.6x106/ml继续培养。7 p; _) E0 E; @0 N1 ^! r U V) E
4.4.4.8定期观察细胞生长情况，主要观察其形态的变化，数目及增值情况，细胞碎片及杂质情况，每2-3天加液培养。& E$ r! j3 i; d' N2 q
4.4.4.9根据细胞状态和临床治疗需要，培养9天时细胞数量达到要求，各项检测合格。包括：无菌检测，内毒素检测，细胞活力，细胞表型等。% l0 v8 c! T/ Z" ~0 B* p7 [
4.4.5 Car-T细胞收集：
5 n, M7 G, T. W4 v3 m# l, }/ K4.4.5.1确认细胞各项检测己符合要求。
. Y$ o# d# \& {$ x2 W, x4.4.5.2根据治疗方案（一般一个疗程分多次回输，间隔时间为1天），取出相应细胞悬液，剩余细胞补加培养基继续培养，供再次回输。
* |4 A- ]2 I# N2 W5 x4.4.5.3细胞悬液转入离心管中，300g离心5min。( M' a* G0 ^1 ?, o2 Y
4.4.5.4除去上清培养液，加PBS缓冲液稀释混匀，300g离心5min，弃上清，PBS缓冲液300g/min离心5min。
1 o1 u' [4 M. p4 `4.4.5.5细胞装袋（一般静脉回输，采用100ml双阀盐水袋），离心完成后取上清，做无菌检测，20ml生理盐水重悬细胞，100μm细胞滤网过滤，取少量细胞悬液进行细胞数量，细胞活率，革兰氏检测，内毒素检测。细胞过滤完成，转入100ml盐水袋中，加5%注射用人血白蛋白，贴上标签，并填写相关记录。
$ C, K1 L( Q" o0 F$ {8 ]+ H4.5细胞运输与保存：. A5 E, s! H6 t4 @
4.5.1核对细胞标签内容，填写回输发放记录。
/ x! [" Q, z9 {2 `0 w4.5.2细胞盐水袋放置于运输容器内（一般为疫苗箱，4度），填写交接记录表。* w/ ~' i. g P/ J
4.5.3运输人员在运输过程中避免距离震荡，并在规定时间内送到。1 E, x. X* w& C! _
4.5.4细胞运输保存温度保持在4度左右，并在规定时间内回输，如果患者不能按时回输，请及时联系实验技术人员，返回实验室。
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发表于 2016-2-16 09:29
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