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本帖最后由 细胞海洋 于 2016-2-16 09:55 编辑
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1 目的：保证Car-T细胞制备和培养符合要求。, W! P3 U9 |# U8 _; { {
2 范围：适用于符合实验的要求患者外周血制备和培养
1 [! v0 @$ i6 ?/ S& K o9 n! C: Z3 责任人：实验员人、临床相关人员。, |3 X/ K W& }4 U$ b; e% `: L# Z! M ?, U
4 内容
5 X- j6 q! ?: v4.1耗材：50ml离心管，10ml移液管，5ml移液管，75cm2培养瓶，150 cm2培养瓶，EP管，1.8ml冻存管
\1 C" U% a0 A8 w8 p5 j5 s4.2试剂：X-VIVO 15TM，PBS缓冲液，75%医用酒精，人淋巴细胞分离液，CD3/CD28免疫磁珠，IL-2，注射用人血白蛋白。
! i& I/ W" j& J7 R4.3环境：
, B C3 M# O: I+ h z4.3.1外周血分离，培养应在恒温恒湿的万级层流室内进行，开放操作必须在百级生物安全柜内进行。7 {. v% {. w% x5 m& q0 h* k* ^& z
4.3.2实验人员应提前对净化室和生物安全柜进行杀菌消毒，紫外线照射时间不少于30min，消毒消毒后，净化空调开启时间不少于30min，生物安全柜运行稳定后方可操作。
& a1 q( O e4 o" O! ?4.4操作：* t( W# W' {% F9 F. ^3 i: U7 @
4.4.1采集接收外周血
$ R0 U/ g1 k( d* @" Z3 q- A/ s4.4.1.1患者符合治疗方案，各项检测符合要求，采集患者外周血60-80ml。
A: b+ `3 i9 G4.4.1.2接收外周血并填写《外周血采集交接记录》，核对外周血患者相关信息，及相应检测报告，报告由医院提供，至少包括：HBsAg，HCVAb，HIVAb，Anti-TP，ALT。$ r7 H8 H5 W5 u) K9 G! n
4.4.2操作前准备4 T. F) U( Z& Z. ]# Z
4.4.2.1净化室，生物安全柜消毒完毕后，开启净化空调运行30min，生物安全柜运行稳定。
2 q9 n+ H* \4 i0 w0 C4.4.2.2从试剂间冰箱中取出细胞培养基，恢复室温。+ p# ~- Z4 g' O K3 y: s2 A& a0 N
4.4.2.3生物安全柜表面75%酒精消毒，外周血袋表面酒精消毒转入安全柜内。. e+ `- C6 L2 G3 X( \( B0 S
4.4.3 分离单个核细胞（PBMC）：
& T% n* T7 s, W9 u) D! ^$ l4.4.3.1使用灭菌消毒的剪刀剪断血袋塑料管或者使用一次性注射器，把血袋内外周血转入50ml离心管中。
! }# p) y' W7 F5 d' F% f `. C4.4.3.2用PBS缓冲液按1:1稀释外周血，混匀。
8 l6 S, a" V$ I$ d; Q4.4.3.3将稀释好的血样缓慢加入室温的15ml人淋巴细胞分离液的离心管中。方法如下：用10ml移液管吸取血样，伸至分离液液面上方0.5cm处，血样自然滑落铺至分离液面上，然后轻轻加入血样，注意不要冲破液面。
* n: m4 O2 U# g4 ? @7 U4.4.3.4配平离心1200g（2100r/min）离心20min，慢升慢降。: Z: `% \5 p( M: f* S
4.4.3.5离心完成后，离心管出现明显分层由下至上：红细胞层，粒细胞层，Ficoll层，单个核细胞层和血浆层。吸取血浆层至距白膜层5mm左右处弃之。小心吸取红细胞层以上的所有液体至离心管中，PBS稀释，与细胞悬液体积比应大于1:3，混匀。
1 f1 o7 y% J8 Z3 T q* X4.4.3.6离心600g（1600r/min）5min，PBS重悬细胞混匀，取少量细胞计数。4 b$ |: y% X8 ]3 e# w- p
4.4.3.7离心300g（1200r/min）5min，上清液送检无菌检测。
4 ?' S; X+ G `: L; ~4.4.4细胞培养：
0 R" B# t/ M( N2 i9 u% Q1 U4 L1 v4.4.4.1细胞培养条件：恒温37℃，CO2浓度 5%，相对饱和湿度95%，细胞培养基PH值7.2-7.4。
! U0 z2 e) h" q; t4.4.4.2根据细胞计数调密度2x106/ml加入培养瓶中（T150 200x106/100ml, T75 100x106/50ml ,T25 50x106/25ml）。混匀放入CO2培养箱培养2小时。
- o9 O8 }+ _' w4 @/ X( V h4.4.4.3取出培养瓶，轻摇，使沉降于底部的悬浮细胞浮起，培养瓶倾斜30度角，移液管吸取培养基转入离心管中，少些培养基洗培养瓶将悬浮细胞全部收集，混匀计数。+ Z* K8 q* z4 v" b: _
4.4.4.4根据细胞计数调整细胞浓度1.2x106/ml接种培养瓶中（100-120ml in a T150，50-60ml in a T75，15-29ml in a T25），加CD3/CD28磁珠，按细胞与磁珠比例为1:3（加之前磁珠用培养基洗涤3次，去除保存液），加入IL-2 100U/ml，混匀放入CO2培养箱培养。 n/ p( B E5 w* P. g. }; {
4.4.4.5次日细胞培养1天，调整细胞密度至0.6x106/ml，加入病毒（MOI为1-5）混匀放入CO2培养箱培养。% Q0 \0 y) x3 X& S
4.4.4.6细胞培养3天，细胞计数补加培养基，IL-2 100U/ml细胞密度调整至0.6x106/ml继续培养。
* d7 g& a# n4 Y2 [! m4.4.4.7细胞培养5天去磁珠，细胞混匀转离心管中，在磁力架上去除磁珠，细胞计数补加培养基，IL-2 100U/ml细胞密度调整至0.6x106/ml继续培养。
/ k3 e9 a3 v! Z* _) b/ f9 G' N4.4.4.8定期观察细胞生长情况，主要观察其形态的变化，数目及增值情况，细胞碎片及杂质情况，每2-3天加液培养。
# l" J+ _% n: ~* b: c- g4.4.4.9根据细胞状态和临床治疗需要，培养9天时细胞数量达到要求，各项检测合格。包括：无菌检测，内毒素检测，细胞活力，细胞表型等。6 F6 A+ }8 L0 X8 f$ C+ z/ a/ E! r4 \
4.4.5 Car-T细胞收集：
: w% ^- x; S; w! A4.4.5.1确认细胞各项检测己符合要求。8 t- Q2 `6 Y4 M$ H8 g( N
4.4.5.2根据治疗方案（一般一个疗程分多次回输，间隔时间为1天），取出相应细胞悬液，剩余细胞补加培养基继续培养，供再次回输。
B- j( [* ^! ^# {+ M, {4.4.5.3细胞悬液转入离心管中，300g离心5min。4 i0 M. w- i7 _: ~0 v' S
4.4.5.4除去上清培养液，加PBS缓冲液稀释混匀，300g离心5min，弃上清，PBS缓冲液300g/min离心5min。* y0 I5 \1 a8 _* A$ ^6 r
4.4.5.5细胞装袋（一般静脉回输，采用100ml双阀盐水袋），离心完成后取上清，做无菌检测，20ml生理盐水重悬细胞，100μm细胞滤网过滤，取少量细胞悬液进行细胞数量，细胞活率，革兰氏检测，内毒素检测。细胞过滤完成，转入100ml盐水袋中，加5%注射用人血白蛋白，贴上标签，并填写相关记录。$ X, ^+ j7 {. }* ~
4.5细胞运输与保存：. g+ {; f8 c7 y# M }
4.5.1核对细胞标签内容，填写回输发放记录。7 c4 N9 `' D9 d# |3 z
4.5.2细胞盐水袋放置于运输容器内（一般为疫苗箱，4度），填写交接记录表。
) O8 u$ |2 n) }" P3 r+ U4.5.3运输人员在运输过程中避免距离震荡，并在规定时间内送到。! Y6 h- J3 t3 Q" X Q x- O
4.5.4细胞运输保存温度保持在4度左右，并在规定时间内回输，如果患者不能按时回输，请及时联系实验技术人员，返回实验室。
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发表于 2016-2-16 09:29
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