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本帖最后由 细胞海洋 于 2016-2-16 09:55 编辑 ) r% G" i# }1 r5 ]
0 z; ?, O, e; P) ~3 o2 w2 T$ g1 目的：保证Car-T细胞制备和培养符合要求。
" _: u- b* C) p2 范围：适用于符合实验的要求患者外周血制备和培养
+ D H6 g1 C- s$ U7 r3 责任人：实验员人、临床相关人员。, N' z4 Q4 A, `/ X
4 内容
+ h/ {) G& P. w3 x4 M' V4.1耗材：50ml离心管，10ml移液管，5ml移液管，75cm2培养瓶，150 cm2培养瓶，EP管，1.8ml冻存管. }: X. k- d0 e1 ]# d+ ]' S' G" D
4.2试剂：X-VIVO 15TM，PBS缓冲液，75%医用酒精，人淋巴细胞分离液，CD3/CD28免疫磁珠，IL-2，注射用人血白蛋白。
1 ? `) H/ j" {: d4.3环境：
1 O# F5 W! S, q3 o) ]" D( Z4.3.1外周血分离，培养应在恒温恒湿的万级层流室内进行，开放操作必须在百级生物安全柜内进行。# r3 W4 Z( S( j) \4 A
4.3.2实验人员应提前对净化室和生物安全柜进行杀菌消毒，紫外线照射时间不少于30min，消毒消毒后，净化空调开启时间不少于30min，生物安全柜运行稳定后方可操作。
: e" ^. A. _' H! d! T4.4操作：
; G4 H: C T, ], ^6 _4.4.1采集接收外周血) M2 G" a/ u% X, M
4.4.1.1患者符合治疗方案，各项检测符合要求，采集患者外周血60-80ml。5 O' n( E |5 X' u5 p7 t
4.4.1.2接收外周血并填写《外周血采集交接记录》，核对外周血患者相关信息，及相应检测报告，报告由医院提供，至少包括：HBsAg，HCVAb，HIVAb，Anti-TP，ALT。
* A+ ^! R/ _) r6 d& }; V$ c8 h4.4.2操作前准备
( N2 ]3 G S& {, a, p' v9 H2 C4 W4.4.2.1净化室，生物安全柜消毒完毕后，开启净化空调运行30min，生物安全柜运行稳定。8 u9 t7 X* |8 C7 `2 e* X
4.4.2.2从试剂间冰箱中取出细胞培养基，恢复室温。
: D0 F/ g5 Y7 @! U5 {4.4.2.3生物安全柜表面75%酒精消毒，外周血袋表面酒精消毒转入安全柜内。3 q! N/ J$ E# E# w' c
4.4.3 分离单个核细胞（PBMC）：3 {0 W# K5 l! _8 f& z" {
4.4.3.1使用灭菌消毒的剪刀剪断血袋塑料管或者使用一次性注射器，把血袋内外周血转入50ml离心管中。6 k+ V* K& K% C5 Y5 I8 A8 C
4.4.3.2用PBS缓冲液按1:1稀释外周血，混匀。2 |: E$ k. a! W) G; w
4.4.3.3将稀释好的血样缓慢加入室温的15ml人淋巴细胞分离液的离心管中。方法如下：用10ml移液管吸取血样，伸至分离液液面上方0.5cm处，血样自然滑落铺至分离液面上，然后轻轻加入血样，注意不要冲破液面。
. X! ~+ J @) |2 r# [; T4.4.3.4配平离心1200g（2100r/min）离心20min，慢升慢降。* J, g1 e0 g& g8 f5 O6 x8 ]! A9 O
4.4.3.5离心完成后，离心管出现明显分层由下至上：红细胞层，粒细胞层，Ficoll层，单个核细胞层和血浆层。吸取血浆层至距白膜层5mm左右处弃之。小心吸取红细胞层以上的所有液体至离心管中，PBS稀释，与细胞悬液体积比应大于1:3，混匀。7 |( j/ P4 U/ Q
4.4.3.6离心600g（1600r/min）5min，PBS重悬细胞混匀，取少量细胞计数。
, J- v2 z6 V6 Z. x: r5 C) }* h4.4.3.7离心300g（1200r/min）5min，上清液送检无菌检测。8 f! C$ A p2 H ?/ ~% b, D
4.4.4细胞培养：, t& ~4 J9 Y# \! }
4.4.4.1细胞培养条件：恒温37℃，CO2浓度 5%，相对饱和湿度95%，细胞培养基PH值7.2-7.4。
# @$ ^$ ^& x5 O4 D$ n0 L4.4.4.2根据细胞计数调密度2x106/ml加入培养瓶中（T150 200x106/100ml, T75 100x106/50ml ,T25 50x106/25ml）。混匀放入CO2培养箱培养2小时。
7 y0 i" U6 n" O2 z! I% U+ G4.4.4.3取出培养瓶，轻摇，使沉降于底部的悬浮细胞浮起，培养瓶倾斜30度角，移液管吸取培养基转入离心管中，少些培养基洗培养瓶将悬浮细胞全部收集，混匀计数。8 Q, y$ l9 {% ]! t K- q8 G
4.4.4.4根据细胞计数调整细胞浓度1.2x106/ml接种培养瓶中（100-120ml in a T150，50-60ml in a T75，15-29ml in a T25），加CD3/CD28磁珠，按细胞与磁珠比例为1:3（加之前磁珠用培养基洗涤3次，去除保存液），加入IL-2 100U/ml，混匀放入CO2培养箱培养。6 a+ C8 g/ u, j! V5 H" j: ?9 L: ]
4.4.4.5次日细胞培养1天，调整细胞密度至0.6x106/ml，加入病毒（MOI为1-5）混匀放入CO2培养箱培养。
* ?* o' m4 R* M$ ~# c7 G4.4.4.6细胞培养3天，细胞计数补加培养基，IL-2 100U/ml细胞密度调整至0.6x106/ml继续培养。, D" N" u/ \" c( n; i
4.4.4.7细胞培养5天去磁珠，细胞混匀转离心管中，在磁力架上去除磁珠，细胞计数补加培养基，IL-2 100U/ml细胞密度调整至0.6x106/ml继续培养。- Y- t1 {& I6 z5 ]8 t- w: i
4.4.4.8定期观察细胞生长情况，主要观察其形态的变化，数目及增值情况，细胞碎片及杂质情况，每2-3天加液培养。# `7 B/ X" A3 o0 \* x$ c- E9 T
4.4.4.9根据细胞状态和临床治疗需要，培养9天时细胞数量达到要求，各项检测合格。包括：无菌检测，内毒素检测，细胞活力，细胞表型等。! e) P" G6 L0 G
4.4.5 Car-T细胞收集：1 D ]) N# v' _/ D4 a* J% l
4.4.5.1确认细胞各项检测己符合要求。8 b9 m9 S/ [" @5 {$ w
4.4.5.2根据治疗方案（一般一个疗程分多次回输，间隔时间为1天），取出相应细胞悬液，剩余细胞补加培养基继续培养，供再次回输。( p5 y" I& f: _/ V
4.4.5.3细胞悬液转入离心管中，300g离心5min。6 `3 q* I7 _- v0 F4 v2 |& M4 T- ?
4.4.5.4除去上清培养液，加PBS缓冲液稀释混匀，300g离心5min，弃上清，PBS缓冲液300g/min离心5min。% X; e9 L2 N0 p; d6 a* ]
4.4.5.5细胞装袋（一般静脉回输，采用100ml双阀盐水袋），离心完成后取上清，做无菌检测，20ml生理盐水重悬细胞，100μm细胞滤网过滤，取少量细胞悬液进行细胞数量，细胞活率，革兰氏检测，内毒素检测。细胞过滤完成，转入100ml盐水袋中，加5%注射用人血白蛋白，贴上标签，并填写相关记录。3 }0 r9 T. b8 W3 ]3 L$ q
4.5细胞运输与保存：% [$ E- l/ ?) g! p/ Z
4.5.1核对细胞标签内容，填写回输发放记录。' A2 `+ k5 f5 l) Q' Q( m- v: N: B
4.5.2细胞盐水袋放置于运输容器内（一般为疫苗箱，4度），填写交接记录表。# d1 |7 i* x& A% J. p# u. [
4.5.3运输人员在运输过程中避免距离震荡，并在规定时间内送到。- R6 Y t. [1 \3 q% k
4.5.4细胞运输保存温度保持在4度左右，并在规定时间内回输，如果患者不能按时回输，请及时联系实验技术人员，返回实验室。( _' K, ^, s- r! W' t+ I( `" g) s
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发表于 2016-2-16 09:29
发表于 2016-7-8 17:16
