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本帖最后由 细胞海洋 于 2016-2-16 09:55 编辑
( y& a- l# E) V1 F% |' w3 H; Y2 s2 M3 _, Q& U2 p4 g
1 目的：保证Car-T细胞制备和培养符合要求。) ?0 U* I2 e8 w
2 范围：适用于符合实验的要求患者外周血制备和培养1 |9 \5 e a: u t: S6 z) H
3 责任人：实验员人、临床相关人员。
6 X0 r* M6 d% v4 内容* g: v, A2 W% w7 N% k
4.1耗材：50ml离心管，10ml移液管，5ml移液管，75cm2培养瓶，150 cm2培养瓶，EP管，1.8ml冻存管
. w/ ?+ N# h: I% w! C# _4.2试剂：X-VIVO 15TM，PBS缓冲液，75%医用酒精，人淋巴细胞分离液，CD3/CD28免疫磁珠，IL-2，注射用人血白蛋白。/ g, M. D% \6 q& `& m5 |- C% C
4.3环境：
8 L2 t) W }8 J5 y3 t" _# M7 E% S! n9 O4.3.1外周血分离，培养应在恒温恒湿的万级层流室内进行，开放操作必须在百级生物安全柜内进行。
: f+ B2 x1 C; p3 ^; Z! M0 {4.3.2实验人员应提前对净化室和生物安全柜进行杀菌消毒，紫外线照射时间不少于30min，消毒消毒后，净化空调开启时间不少于30min，生物安全柜运行稳定后方可操作。9 p+ q1 }4 \* w6 k; ]+ z9 W1 B
4.4操作：
5 i- Q7 N5 D% y) Z! a( _4.4.1采集接收外周血: u0 h% y( n ~% M2 ^/ W9 L- f
4.4.1.1患者符合治疗方案，各项检测符合要求，采集患者外周血60-80ml。
_% Q, ~" j/ p3 u" n9 R7 y: N( H4.4.1.2接收外周血并填写《外周血采集交接记录》，核对外周血患者相关信息，及相应检测报告，报告由医院提供，至少包括：HBsAg，HCVAb，HIVAb，Anti-TP，ALT。) f1 B- |% }6 v$ L5 _. [% D
4.4.2操作前准备
) U/ g( V; Q# ~4.4.2.1净化室，生物安全柜消毒完毕后，开启净化空调运行30min，生物安全柜运行稳定。% ]# _. y3 n& s9 m: @
4.4.2.2从试剂间冰箱中取出细胞培养基，恢复室温。: j4 O8 o1 Q0 b2 M: B; `
4.4.2.3生物安全柜表面75%酒精消毒，外周血袋表面酒精消毒转入安全柜内。
5 U2 s7 _: l3 i3 k# }0 n- i- ^4.4.3 分离单个核细胞（PBMC）：2 y% o+ x; x* g4 ~; t
4.4.3.1使用灭菌消毒的剪刀剪断血袋塑料管或者使用一次性注射器，把血袋内外周血转入50ml离心管中。8 R: B& M$ c1 Y& ~/ T, w
4.4.3.2用PBS缓冲液按1:1稀释外周血，混匀。
- \, y) I: l! {4 h- `1 x- y4 X4.4.3.3将稀释好的血样缓慢加入室温的15ml人淋巴细胞分离液的离心管中。方法如下：用10ml移液管吸取血样，伸至分离液液面上方0.5cm处，血样自然滑落铺至分离液面上，然后轻轻加入血样，注意不要冲破液面。
! s. `4 E, T4 m1 O( @4.4.3.4配平离心1200g（2100r/min）离心20min，慢升慢降。
. S0 @1 O- i1 ~! \4.4.3.5离心完成后，离心管出现明显分层由下至上：红细胞层，粒细胞层，Ficoll层，单个核细胞层和血浆层。吸取血浆层至距白膜层5mm左右处弃之。小心吸取红细胞层以上的所有液体至离心管中，PBS稀释，与细胞悬液体积比应大于1:3，混匀。
* F& v( N- h) v$ u" w9 m# A4.4.3.6离心600g（1600r/min）5min，PBS重悬细胞混匀，取少量细胞计数。/ P6 @: O& U. X
4.4.3.7离心300g（1200r/min）5min，上清液送检无菌检测。
: H p7 a. O r4.4.4细胞培养：, ]" c! ]2 v+ d. M4 ~1 k) ?
4.4.4.1细胞培养条件：恒温37℃，CO2浓度 5%，相对饱和湿度95%，细胞培养基PH值7.2-7.4。
: M1 Q1 q6 V& X2 l# F) {4.4.4.2根据细胞计数调密度2x106/ml加入培养瓶中（T150 200x106/100ml, T75 100x106/50ml ,T25 50x106/25ml）。混匀放入CO2培养箱培养2小时。0 T# o% H- B& Y
4.4.4.3取出培养瓶，轻摇，使沉降于底部的悬浮细胞浮起，培养瓶倾斜30度角，移液管吸取培养基转入离心管中，少些培养基洗培养瓶将悬浮细胞全部收集，混匀计数。
# [; H5 w3 f9 S/ p) w8 z4.4.4.4根据细胞计数调整细胞浓度1.2x106/ml接种培养瓶中（100-120ml in a T150，50-60ml in a T75，15-29ml in a T25），加CD3/CD28磁珠，按细胞与磁珠比例为1:3（加之前磁珠用培养基洗涤3次，去除保存液），加入IL-2 100U/ml，混匀放入CO2培养箱培养。
& H7 S* X" M; j" N9 A4.4.4.5次日细胞培养1天，调整细胞密度至0.6x106/ml，加入病毒（MOI为1-5）混匀放入CO2培养箱培养。
0 D0 J4 ?* P2 u! f( F! t4 N; o4.4.4.6细胞培养3天，细胞计数补加培养基，IL-2 100U/ml细胞密度调整至0.6x106/ml继续培养。
. }( Z! @" }! h& Q8 t8 U4.4.4.7细胞培养5天去磁珠，细胞混匀转离心管中，在磁力架上去除磁珠，细胞计数补加培养基，IL-2 100U/ml细胞密度调整至0.6x106/ml继续培养。- m B P l- z) b5 X# y ]
4.4.4.8定期观察细胞生长情况，主要观察其形态的变化，数目及增值情况，细胞碎片及杂质情况，每2-3天加液培养。
; W7 {6 Y7 L j% V" s4.4.4.9根据细胞状态和临床治疗需要，培养9天时细胞数量达到要求，各项检测合格。包括：无菌检测，内毒素检测，细胞活力，细胞表型等。. ]1 m+ e% i5 C
4.4.5 Car-T细胞收集：
5 J2 @! ~0 J$ g/ s9 j4 P2 v* U4.4.5.1确认细胞各项检测己符合要求。. }: n( X. t" a& J2 k1 V
4.4.5.2根据治疗方案（一般一个疗程分多次回输，间隔时间为1天），取出相应细胞悬液，剩余细胞补加培养基继续培养，供再次回输。# s$ P& _! y* Z
4.4.5.3细胞悬液转入离心管中，300g离心5min。' }3 Y) Z. s0 u) N9 `9 r
4.4.5.4除去上清培养液，加PBS缓冲液稀释混匀，300g离心5min，弃上清，PBS缓冲液300g/min离心5min。5 M+ p. |* \$ n( y+ r
4.4.5.5细胞装袋（一般静脉回输，采用100ml双阀盐水袋），离心完成后取上清，做无菌检测，20ml生理盐水重悬细胞，100μm细胞滤网过滤，取少量细胞悬液进行细胞数量，细胞活率，革兰氏检测，内毒素检测。细胞过滤完成，转入100ml盐水袋中，加5%注射用人血白蛋白，贴上标签，并填写相关记录。) ~ I# J6 u; o4 d) Z
4.5细胞运输与保存：
. S* w8 X( d9 x4.5.1核对细胞标签内容，填写回输发放记录。6 p7 k4 x) M* F; T
4.5.2细胞盐水袋放置于运输容器内（一般为疫苗箱，4度），填写交接记录表。
3 K! j$ t7 ~" @# ^) D6 ^ h5 E+ ]6 q4.5.3运输人员在运输过程中避免距离震荡，并在规定时间内送到。" t2 q7 Y+ f, E4 O
4.5.4细胞运输保存温度保持在4度左右，并在规定时间内回输，如果患者不能按时回输，请及时联系实验技术人员，返回实验室。
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发表于 2016-2-16 09:29
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