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本帖最后由 细胞海洋 于 2016-2-16 09:55 编辑
: U6 z. y8 Z, ~! N
2 }8 ]3 Y* p4 e3 d5 e1 目的：保证Car-T细胞制备和培养符合要求。: h8 p' t: O# M! F6 v
2 范围：适用于符合实验的要求患者外周血制备和培养* G% }& V5 g& D" }- G' C, l9 k
3 责任人：实验员人、临床相关人员。
6 d; P2 n& _; k* U% a9 e' C4 内容
; S9 } T0 @2 I5 O4.1耗材：50ml离心管，10ml移液管，5ml移液管，75cm2培养瓶，150 cm2培养瓶，EP管，1.8ml冻存管8 m+ O7 H& N5 f, ^9 j& P; M
4.2试剂：X-VIVO 15TM，PBS缓冲液，75%医用酒精，人淋巴细胞分离液，CD3/CD28免疫磁珠，IL-2，注射用人血白蛋白。' v. i/ x& U3 C. R" T4 i6 ~6 j
4.3环境：/ q( q9 p1 v( }3 b0 h5 J
4.3.1外周血分离，培养应在恒温恒湿的万级层流室内进行，开放操作必须在百级生物安全柜内进行。: W* f& r9 j- p. i7 W8 o e
4.3.2实验人员应提前对净化室和生物安全柜进行杀菌消毒，紫外线照射时间不少于30min，消毒消毒后，净化空调开启时间不少于30min，生物安全柜运行稳定后方可操作。4 s$ [# g3 J1 I. W/ ~
4.4操作：
( g9 J& j/ I4 H. E6 `3 g0 N4.4.1采集接收外周血% Y5 @$ o, p( I! i& F6 i
4.4.1.1患者符合治疗方案，各项检测符合要求，采集患者外周血60-80ml。
! K) C) b, R5 v4.4.1.2接收外周血并填写《外周血采集交接记录》，核对外周血患者相关信息，及相应检测报告，报告由医院提供，至少包括：HBsAg，HCVAb，HIVAb，Anti-TP，ALT。
& q& k1 P8 o$ [- r |4.4.2操作前准备
; m4 n$ G( V; \" r: n+ V4.4.2.1净化室，生物安全柜消毒完毕后，开启净化空调运行30min，生物安全柜运行稳定。! x8 S+ ^) @ }4 w& W
4.4.2.2从试剂间冰箱中取出细胞培养基，恢复室温。! Y" t" J" A5 Z% K# R4 T6 k$ v
4.4.2.3生物安全柜表面75%酒精消毒，外周血袋表面酒精消毒转入安全柜内。
, z7 c- @1 S* ~2 y. z/ |4.4.3 分离单个核细胞（PBMC）：
1 k6 ~' ~0 ?' Z' [7 p4.4.3.1使用灭菌消毒的剪刀剪断血袋塑料管或者使用一次性注射器，把血袋内外周血转入50ml离心管中。1 u/ W4 V: r" H! D7 H
4.4.3.2用PBS缓冲液按1:1稀释外周血，混匀。
; t; {) f/ ^5 q7 E. \8 ]- {6 r9 [( t4.4.3.3将稀释好的血样缓慢加入室温的15ml人淋巴细胞分离液的离心管中。方法如下：用10ml移液管吸取血样，伸至分离液液面上方0.5cm处，血样自然滑落铺至分离液面上，然后轻轻加入血样，注意不要冲破液面。
% G- t0 r0 H" p) _$ {% M# H4.4.3.4配平离心1200g（2100r/min）离心20min，慢升慢降。* \; p: K$ P8 v. ~2 `1 C i& P
4.4.3.5离心完成后，离心管出现明显分层由下至上：红细胞层，粒细胞层，Ficoll层，单个核细胞层和血浆层。吸取血浆层至距白膜层5mm左右处弃之。小心吸取红细胞层以上的所有液体至离心管中，PBS稀释，与细胞悬液体积比应大于1:3，混匀。. I3 [# G/ H( M6 Z% }# v+ O0 O4 s Z; O
4.4.3.6离心600g（1600r/min）5min，PBS重悬细胞混匀，取少量细胞计数。
9 z0 G6 v S6 {4.4.3.7离心300g（1200r/min）5min，上清液送检无菌检测。- `8 I9 i6 N. ~6 f
4.4.4细胞培养：# Q" t$ e& g1 R1 Q: A
4.4.4.1细胞培养条件：恒温37℃，CO2浓度 5%，相对饱和湿度95%，细胞培养基PH值7.2-7.4。4 Y0 D7 l* R$ {& v5 I
4.4.4.2根据细胞计数调密度2x106/ml加入培养瓶中（T150 200x106/100ml, T75 100x106/50ml ,T25 50x106/25ml）。混匀放入CO2培养箱培养2小时。! ^/ _ a5 ~1 b1 a
4.4.4.3取出培养瓶，轻摇，使沉降于底部的悬浮细胞浮起，培养瓶倾斜30度角，移液管吸取培养基转入离心管中，少些培养基洗培养瓶将悬浮细胞全部收集，混匀计数。" N2 |6 {1 \5 E4 u% N$ z
4.4.4.4根据细胞计数调整细胞浓度1.2x106/ml接种培养瓶中（100-120ml in a T150，50-60ml in a T75，15-29ml in a T25），加CD3/CD28磁珠，按细胞与磁珠比例为1:3（加之前磁珠用培养基洗涤3次，去除保存液），加入IL-2 100U/ml，混匀放入CO2培养箱培养。5 v, \/ f1 f$ ^, ~6 }! S; A
4.4.4.5次日细胞培养1天，调整细胞密度至0.6x106/ml，加入病毒（MOI为1-5）混匀放入CO2培养箱培养。5 Y5 i0 ^# l- `5 \/ {) w% o
4.4.4.6细胞培养3天，细胞计数补加培养基，IL-2 100U/ml细胞密度调整至0.6x106/ml继续培养。7 p3 H' u( o# q/ `3 O& P' y2 g
4.4.4.7细胞培养5天去磁珠，细胞混匀转离心管中，在磁力架上去除磁珠，细胞计数补加培养基，IL-2 100U/ml细胞密度调整至0.6x106/ml继续培养。
8 B! \7 v$ D1 D4.4.4.8定期观察细胞生长情况，主要观察其形态的变化，数目及增值情况，细胞碎片及杂质情况，每2-3天加液培养。7 B. j; l9 u/ M3 U
4.4.4.9根据细胞状态和临床治疗需要，培养9天时细胞数量达到要求，各项检测合格。包括：无菌检测，内毒素检测，细胞活力，细胞表型等。6 X' x ~" ]4 A i
4.4.5 Car-T细胞收集：
( v% s) p+ ~1 ]# T1 ^6 w4.4.5.1确认细胞各项检测己符合要求。+ a; k' f5 `# E
4.4.5.2根据治疗方案（一般一个疗程分多次回输，间隔时间为1天），取出相应细胞悬液，剩余细胞补加培养基继续培养，供再次回输。
! F7 X1 b; ?9 v; m( q) ~4.4.5.3细胞悬液转入离心管中，300g离心5min。& o2 O" K% L& S7 |! }) |- H
4.4.5.4除去上清培养液，加PBS缓冲液稀释混匀，300g离心5min，弃上清，PBS缓冲液300g/min离心5min。' n/ b9 ~; ~( S7 }
4.4.5.5细胞装袋（一般静脉回输，采用100ml双阀盐水袋），离心完成后取上清，做无菌检测，20ml生理盐水重悬细胞，100μm细胞滤网过滤，取少量细胞悬液进行细胞数量，细胞活率，革兰氏检测，内毒素检测。细胞过滤完成，转入100ml盐水袋中，加5%注射用人血白蛋白，贴上标签，并填写相关记录。
) |! o5 Q) ]7 V- @7 K: Z4.5细胞运输与保存：
9 E( q* P9 a4 G+ W: `2 k4.5.1核对细胞标签内容，填写回输发放记录。# H2 R: h: B6 G' C) N) D
4.5.2细胞盐水袋放置于运输容器内（一般为疫苗箱，4度），填写交接记录表。
0 [5 c" B2 ~% J. E, p! E/ d8 b3 A5 p4.5.3运输人员在运输过程中避免距离震荡，并在规定时间内送到。
4 V5 s3 t3 g' x. G% i4.5.4细胞运输保存温度保持在4度左右，并在规定时间内回输，如果患者不能按时回输，请及时联系实验技术人员，返回实验室。* \8 }4 c4 W; e6 I& Y) w
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发表于 2016-2-16 09:29
发表于 2016-7-8 17:16
