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本帖最后由 细胞海洋 于 2016-2-16 09:55 编辑
1 U; i9 a! l* M# y9 J, Q
" ]1 F- s, M6 w+ l/ R1 目的：保证Car-T细胞制备和培养符合要求。; Y y6 Y$ v. C o* p5 o
2 范围：适用于符合实验的要求患者外周血制备和培养1 N, h" E* T: z, j5 _
3 责任人：实验员人、临床相关人员。
* K3 O: D$ r1 W5 x; x- J7 P3 R! L4 内容$ L3 B- s/ v; @7 m0 c/ m
4.1耗材：50ml离心管，10ml移液管，5ml移液管，75cm2培养瓶，150 cm2培养瓶，EP管，1.8ml冻存管
" J" u M; [$ W/ c- q4.2试剂：X-VIVO 15TM，PBS缓冲液，75%医用酒精，人淋巴细胞分离液，CD3/CD28免疫磁珠，IL-2，注射用人血白蛋白。
* t7 U' P; c; f( I' [: ~" K4.3环境：
7 u0 x e7 @# F% l2 x2 B4.3.1外周血分离，培养应在恒温恒湿的万级层流室内进行，开放操作必须在百级生物安全柜内进行。
0 ^4 F( u# x2 z% @5 K: A. u8 x4 J9 b' Y4.3.2实验人员应提前对净化室和生物安全柜进行杀菌消毒，紫外线照射时间不少于30min，消毒消毒后，净化空调开启时间不少于30min，生物安全柜运行稳定后方可操作。7 ?. u, T) j# @# Z% |+ b9 {
4.4操作：- K7 [! \6 |' s& q6 t+ Y9 f
4.4.1采集接收外周血
& f4 G! k9 o9 k) F4.4.1.1患者符合治疗方案，各项检测符合要求，采集患者外周血60-80ml。
/ |2 c9 x6 C; r9 H4.4.1.2接收外周血并填写《外周血采集交接记录》，核对外周血患者相关信息，及相应检测报告，报告由医院提供，至少包括：HBsAg，HCVAb，HIVAb，Anti-TP，ALT。, d. B8 ?% U" l
4.4.2操作前准备
( `$ t- s$ V3 p+ T8 u0 t4.4.2.1净化室，生物安全柜消毒完毕后，开启净化空调运行30min，生物安全柜运行稳定。
O5 r P7 Q' e+ L- d5 I- G/ K4.4.2.2从试剂间冰箱中取出细胞培养基，恢复室温。 v# C) z* C' N1 J, ~, v) A
4.4.2.3生物安全柜表面75%酒精消毒，外周血袋表面酒精消毒转入安全柜内。* q8 i# F) ` L4 h; u3 C- J: ^% l
4.4.3 分离单个核细胞（PBMC）：
4 l/ q6 C1 N( G2 O: {4.4.3.1使用灭菌消毒的剪刀剪断血袋塑料管或者使用一次性注射器，把血袋内外周血转入50ml离心管中。
: ~! w# m0 I. z4.4.3.2用PBS缓冲液按1:1稀释外周血，混匀。
& J' j; z" i1 ~; w) P# {2 @( u4.4.3.3将稀释好的血样缓慢加入室温的15ml人淋巴细胞分离液的离心管中。方法如下：用10ml移液管吸取血样，伸至分离液液面上方0.5cm处，血样自然滑落铺至分离液面上，然后轻轻加入血样，注意不要冲破液面。
0 R, H7 d% H T9 d# c4.4.3.4配平离心1200g（2100r/min）离心20min，慢升慢降。
' f& a9 F4 Z1 h, b+ b8 F4.4.3.5离心完成后，离心管出现明显分层由下至上：红细胞层，粒细胞层，Ficoll层，单个核细胞层和血浆层。吸取血浆层至距白膜层5mm左右处弃之。小心吸取红细胞层以上的所有液体至离心管中，PBS稀释，与细胞悬液体积比应大于1:3，混匀。+ S+ G3 H9 a( F$ h; `/ [; w( @, }
4.4.3.6离心600g（1600r/min）5min，PBS重悬细胞混匀，取少量细胞计数。
7 m. o& ]8 K& l1 I# R+ ]4.4.3.7离心300g（1200r/min）5min，上清液送检无菌检测。
1 C5 _0 n9 v# o( s/ y4.4.4细胞培养：
! \# c" I& F0 k- e4.4.4.1细胞培养条件：恒温37℃，CO2浓度 5%，相对饱和湿度95%，细胞培养基PH值7.2-7.4。0 f0 p3 r( n2 `0 ]6 }
4.4.4.2根据细胞计数调密度2x106/ml加入培养瓶中（T150 200x106/100ml, T75 100x106/50ml ,T25 50x106/25ml）。混匀放入CO2培养箱培养2小时。6 c8 g2 n$ \; L [
4.4.4.3取出培养瓶，轻摇，使沉降于底部的悬浮细胞浮起，培养瓶倾斜30度角，移液管吸取培养基转入离心管中，少些培养基洗培养瓶将悬浮细胞全部收集，混匀计数。
3 e7 _3 q* M: ?6 W' M" \4.4.4.4根据细胞计数调整细胞浓度1.2x106/ml接种培养瓶中（100-120ml in a T150，50-60ml in a T75，15-29ml in a T25），加CD3/CD28磁珠，按细胞与磁珠比例为1:3（加之前磁珠用培养基洗涤3次，去除保存液），加入IL-2 100U/ml，混匀放入CO2培养箱培养。
' h( {" f ~" C) o6 F1 k4.4.4.5次日细胞培养1天，调整细胞密度至0.6x106/ml，加入病毒（MOI为1-5）混匀放入CO2培养箱培养。
' p- @( ?. e- `" q/ ^; B$ Z# [4.4.4.6细胞培养3天，细胞计数补加培养基，IL-2 100U/ml细胞密度调整至0.6x106/ml继续培养。& ~3 i& Y `, }# U3 N) [5 ?
4.4.4.7细胞培养5天去磁珠，细胞混匀转离心管中，在磁力架上去除磁珠，细胞计数补加培养基，IL-2 100U/ml细胞密度调整至0.6x106/ml继续培养。& a6 n9 }8 l( i- \
4.4.4.8定期观察细胞生长情况，主要观察其形态的变化，数目及增值情况，细胞碎片及杂质情况，每2-3天加液培养。
* L: W+ W( q; o4.4.4.9根据细胞状态和临床治疗需要，培养9天时细胞数量达到要求，各项检测合格。包括：无菌检测，内毒素检测，细胞活力，细胞表型等。
2 \" J& Q& u1 F" n& C$ v+ t4.4.5 Car-T细胞收集：5 r* G- E0 ?9 e5 X% C
4.4.5.1确认细胞各项检测己符合要求。2 H' y6 S. u& B% }5 d% K; d
4.4.5.2根据治疗方案（一般一个疗程分多次回输，间隔时间为1天），取出相应细胞悬液，剩余细胞补加培养基继续培养，供再次回输。
$ ]* l; }% X0 U' ^9 W4.4.5.3细胞悬液转入离心管中，300g离心5min。
8 @8 J) R( V1 Y/ Q/ B7 z4.4.5.4除去上清培养液，加PBS缓冲液稀释混匀，300g离心5min，弃上清，PBS缓冲液300g/min离心5min。/ b% }) A9 O3 H8 @. z7 a* w5 V
4.4.5.5细胞装袋（一般静脉回输，采用100ml双阀盐水袋），离心完成后取上清，做无菌检测，20ml生理盐水重悬细胞，100μm细胞滤网过滤，取少量细胞悬液进行细胞数量，细胞活率，革兰氏检测，内毒素检测。细胞过滤完成，转入100ml盐水袋中，加5%注射用人血白蛋白，贴上标签，并填写相关记录。; l' ^8 U' O6 A* H/ w
4.5细胞运输与保存：2 ^% B* I7 D' h# f
4.5.1核对细胞标签内容，填写回输发放记录。- }* Y. P0 k( U
4.5.2细胞盐水袋放置于运输容器内（一般为疫苗箱，4度），填写交接记录表。
8 N/ F% ?* p9 V4.5.3运输人员在运输过程中避免距离震荡，并在规定时间内送到。
j% B) y0 H; B# ]4.5.4细胞运输保存温度保持在4度左右，并在规定时间内回输，如果患者不能按时回输，请及时联系实验技术人员，返回实验室。
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发表于 2016-2-16 09:29
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