CAR-T细胞培养中慢病毒转染的问题

木子小王令

回复 riverdtang 的帖子
9 ?# _7 b$ [: s. T6 k0 i) }) p4 i1 W: W
是的，感觉自己还是操作有问题。. p0 R. s' S1 X0 u  ^; y
是别人给的培养第九天的Tcell，我每孔取了3×105接的。因为以前慢病毒转染时候一般都是在转染时细胞汇合度达30~50%，所以这回转Tcell也想当然的沿用这个规律。
+ Y3 \( H3 ~7 r# F8 q& b9 E/ e& n1 n3 q, A
请问你是在Tcell初始分离后就开始用抗体刺激吗？是不是这个时期的Tcell活力比较高呢？（我之前用的Tcell是不是有点老了？）
  y* {% J. s! D) o  h5 y, n% v  n4 Z+ w: O
铺板密度如果是10^6/ml，6孔板铺1ml就可以的吧？接种第二天做转染，然后24h后再换液？
7 |: F: G; ^$ `

yanxm920

没有遇到过呢

riverdtang

回复 木子小王令 的帖子
6 a/ e# g% ]1 I1 U4 b! u4 l' t7 A, a4 G- n
T细胞分离后用抗体刺激48h转，MOI：10-50我们的转染率就很高了，50%以上吧，感染第二天换液，铺板密度10^6/ml都可以，我觉得可能还是细胞激活的问题

木子小王令

回复 riverdtang 的帖子
, O% F; u6 G7 D! B2 W! B
$ @9 g: i5 j) _; {! e你好！我是刚接触慢病毒转Tcell的实验，请问初始摸索的过程中，一般慢病毒转染Tell的时机，细胞接种量，MOI可以设定多大的梯度范围呢？我试过一次，Tell接到6孔板中是3×10^5/well，MOI为200，作用时间48h都没有换液，细胞状态还是很好，但是转染效率很低，不足10%的样子。

ET生物人

慢慢发现，不同人的T细胞感染效率差异有点大！！你们做的T细胞是来自哪里？来源稳定吗？

riverdtang

回复 六弦七品 的帖子
3 N9 Y8 H+ [+ h! U4 l
. {- C* c* z7 u6 wT细胞可比293T难转多了，293T只要活着、状态不差，都能转进去的，T细胞分离后转染的时机，MOI，刺激的条件都很重要，建议你还是用GFP病毒转一下T细胞，优化T细胞本身的转染效率再转CAR

六弦七品

回复 riverdtang 的帖子
+ ]0 ]- Q0 T; Y- ?4 {* b
, [8 o9 @% i0 ]" @我们转T细胞的同时转293T，293T是可以检测到CAR的，T细胞检测不到，现在不知道问题出在哪

riverdtang

你是CART转不进去还是病毒转不进去， 如果只是CART的话要考虑载体和病毒的问题，比如启动子啊，滴度，转染时机等，如果对照GFP都转不进去的话可能就是体系或者细胞的问题了

winqi

polybrene 肯定有毒性的，而且毒性还比较的大，需要换，你用的cmv还ef-1a作启动子啊？这两个可能有不同！

六弦七品

回复 zmfang555 的帖子5 S$ T* b7 q8 p+ B5 j$ p
0 O) {0 m2 P: _$ X2 n
没用增强剂，有人说是慢病毒的VSVG蛋白对细胞有毒性，做过的人有遇到类似情况吗？