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CAR-T细胞培养中慢病毒转染的问题  

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发表于 2016-3-24 10:42 |显示全部帖子
最近养CAR-T细胞转染效率老是上不去,大家病毒滴度一般用多少?转染后细胞状态明显变差,照理说用的慢病毒都是缺陷病毒,不能复制,进入细胞后又不会消耗细胞营养,为什么对细胞损伤这么高?
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金话筒 优秀会员

发表于 2016-3-24 14:14 |显示全部帖子
你是不是用了polybrene?如果用了这个增强剂的话,会对细胞产生毒性,毒性强度与你加的量有关.
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发表于 2016-3-25 11:35 |显示全部帖子
希瑞干细胞
回复 zmfang555 的帖子
: z* a- ^+ O; v& f  D1 ^
& |! b( ~8 T8 |% a没用增强剂,有人说是慢病毒的VSVG蛋白对细胞有毒性,做过的人有遇到类似情况吗?
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发表于 2016-3-25 16:46 |显示全部帖子
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polybrene 肯定有毒性的,而且毒性还比较的大,需要换,你用的cmv还ef-1a作启动子啊?这两个可能有不同!
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发表于 2016-3-28 10:35 |显示全部帖子
你是CART转不进去还是病毒转不进去, 如果只是CART的话要考虑载体和病毒的问题,比如启动子啊,滴度,转染时机等,如果对照GFP都转不进去的话可能就是体系或者细胞的问题了
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发表于 2016-3-30 09:41 |显示全部帖子
回复 riverdtang 的帖子
/ E& F/ w$ x1 s0 v
+ Z% i1 z) [$ N$ y4 s6 ~我们转T细胞的同时转293T,293T是可以检测到CAR的,T细胞检测不到,现在不知道问题出在哪
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发表于 2016-3-30 09:49 |显示全部帖子
回复 六弦七品 的帖子8 ^5 V* K7 ~% ^/ }9 u7 I5 n
/ z1 i& m' s& K- C
T细胞可比293T难转多了,293T只要活着、状态不差,都能转进去的,T细胞分离后转染的时机,MOI,刺激的条件都很重要,建议你还是用GFP病毒转一下T细胞,优化T细胞本身的转染效率再转CAR
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发表于 2016-3-30 13:19 |显示全部帖子
慢慢发现,不同人的T细胞感染效率差异有点大!!你们做的T细胞是来自哪里?来源稳定吗?
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发表于 2016-3-30 14:20 |显示全部帖子
回复 riverdtang 的帖子$ i" ~" G) x( G$ H
- E0 z, O* v5 e
你好!我是刚接触慢病毒转Tcell的实验,请问初始摸索的过程中,一般慢病毒转染Tell的时机,细胞接种量,MOI可以设定多大的梯度范围呢?我试过一次,Tell接到6孔板中是3×10^5/well,MOI为200,作用时间48h都没有换液,细胞状态还是很好,但是转染效率很低,不足10%的样子。
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发表于 2016-3-30 16:24 |显示全部帖子
回复 木子小王令 的帖子  g! ^; z# y! J, q

  ^! L1 }) [, hT细胞分离后用抗体刺激48h转,MOI:10-50我们的转染率就很高了,50%以上吧,感染第二天换液,铺板密度10^6/ml都可以,我觉得可能还是细胞激活的问题
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