内皮祖细胞的分离

Diane0321

实验要用到内皮祖细胞，但是我刚进实验室，并没有什么经验，在做之前，想请教一下有经验的大神们，有没有比较完整的分离和培养步骤以及注意事项什么的，非常感谢~~

coffee.cat105

内皮祖啊，你要先搞清楚自己想要的到底是会生长会成血管的那种呢，还是不长的那种，不然很容易坑…………

Diane0321

哦哦，我是要会生成血管的，刚进实验室不久，很多东西都不懂呢，你有什么建议吗？

coffee.cat105

/ C/ l6 a1 U! ?" H: Y& U

" M" S" y5 o$ m3 x" x; c% ^7 K: S: ?4 d+ {' G' i
这个简单啊，我们做就下面几步2 Q* G1 P+ Y( r+ K3 B
1] Fibronectin铺6孔板，过夜
1 r  \& D: \  ]  x5 t2] 新鲜血20ml，ficoll分离脐血单个核细胞，200gX5min，洗涤细胞1次，EGM-2培养基重悬。' w( R0 q: {4 M  |0 q
3] 1X107/cm2密度将细胞接种到铺好Fibronectin的6孔板中，37℃、5%CO2条件下培养。& {# I& r4 s. P1 p) B" o
细胞培养24h后换液，之后3d换液一次。
' @2 {! w! N# p7 H6 ^( L4] 7-10天形成铺路石样克隆，基本每孔都有1-2个，差不多就正常传代就可以了。- L" T* I! O& @2 v1 F, r
5]1传3的密度传，大概也就３天长满的样子
- N; F6 E$ M6 M% ^/ Y( p没了，很容易的
: [7 N; m7 x* z2 t1 K; f不要用瓶，瓶容易坑; \5 P- L( P' Z7 L$ m2 M' Z" ]
不要用羟乙基淀粉分离单个核，容易不贴壁( ~' }3 K1 p$ x( w1 z
培养基用lonza的EGM-2就可以，EGM-2mv也行，只要看你下面的实验，在长出来这一步没有区别% P% v2 P' c: i* u5 q! L& ~
4代之内成血管都不会有太大问题，4代以后成的血管就可能会不太好看

Diane0321

嗯嗯   非常感谢您的帮助  

meredith603

单个核细胞种入皿里（每孔4ml培养基）后第一次换液时间推荐是4天后，而且这4天里不要摇动皿不用观察。这样每个六孔板的孔中多则可以达到20多个克隆，少则也有三五个克隆。传代的时候还是计数一下细胞，每孔（六孔板）5*10^4细胞比较容易长起来，但是其实每孔1000个细胞也能长起来，扩增倍数可以达到400-500倍，也可以形成二次克隆。

meredith603

另外，血液千万要用肝素而不是其他抗凝剂抗凝。羟乙基淀粉基本长不出克隆。