测序问题？

gxbzjznn

大家好，最近在做分子实验，设计引物P基因，PCR结束将未纯化的PCR产物送去测序（50ul体系，自带10ul上、下游引物，单向测序），但是测序结果出来的序列大小跟我设计引物P出来的目的片段大小不一致！比如，有个基因，设计引物和pcr产物片段大小都是102bp,但是测序只有59bp，之后将测得的序列到NCBI上进行序列比对，结果跟我设计引物参照的序列也比对上了（58/59）。请问这种结果真实可信吗？能够放在论文附录里面吗！？

wuhuaguo88l

按某公司的送样要求：未纯化的PCR产物，1片段大于150bp；2提供30-50μlPCR产物（20ng/μl，总量大于600ng），若取3μl样品，应能清晰的分辨出目的条带，你能确定你的样本能符合这些要求吗？

gxbzjznn

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" W6 m& G# x% i4 Z除了1不符合，其他均符合！因为是做定量试验。所以目的片段都不大！

watchen198891

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( u1 O* U+ L0 p$ G! i
& f9 @3 \1 r  b% k0 @3 [( e- ?3 p一般测序前面的一段都是不正确的，所以你单独拿100bp长度的DNA去测序可能有点不太准确，为了确保正确最好连接在T载体上再去测序，估计这样要可靠一些。
/ Q( F- J# f) Y6 i

gxbzjznn

回复 watchen198891 的帖子0 [6 g2 q+ `0 y0 z
/ \( i9 T# N" w
但是拿到的这个短片段59bp测序结果去ncbi上比对也能跟我需要比对的目的序列比中

gxbzjznn

回复 watchen198891 的帖子' B% v4 O# K# [( g/ ^9 p+ @% a
" W% M# R. z$ C; m
请问这个比对结果说服力强吗？可以用吗？因为不想连载体做克隆了

春玲子

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7 W2 K3 V/ G/ U6 Y. M+ b) E# b4 D" Z+ _4 L/ B9 }  }. ?6 I
你扩增出来的基因不是你的目的基因，结果不可靠。

watchen198891

回复 gxbzjznn 的帖子5 l2 w- l& l1 Q3 G2 i

' @0 u. Z! v, E7 g0 w; |4 v不具备说服力，测序结果中正确的序列太短。

gxbzjznn

回复 春玲子 的帖子9 H8 X8 ]! W) b- u$ t' [
& X: ~+ l  h3 K
怎么讲？

gxbzjznn

回复 watchen198891 的帖子+ ~. q9 G0 L. _/ [/ m

$ F- @3 G4 V. C4 J; U太短？