测序问题？

gxbzjznn

大家好，最近在做分子实验，设计引物P基因，PCR结束将未纯化的PCR产物送去测序（50ul体系，自带10ul上、下游引物，单向测序），但是测序结果出来的序列大小跟我设计引物P出来的目的片段大小不一致！比如，有个基因，设计引物和pcr产物片段大小都是102bp,但是测序只有59bp，之后将测得的序列到NCBI上进行序列比对，结果跟我设计引物参照的序列也比对上了（58/59）。请问这种结果真实可信吗？能够放在论文附录里面吗！？

wuhuaguo88l

按某公司的送样要求：未纯化的PCR产物，1片段大于150bp；2提供30-50μlPCR产物（20ng/μl，总量大于600ng），若取3μl样品，应能清晰的分辨出目的条带，你能确定你的样本能符合这些要求吗？

gxbzjznn

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  x7 k& H& ?1 P( A
6 o: E0 @- M0 Y( s+ Y% X) o除了1不符合，其他均符合！因为是做定量试验。所以目的片段都不大！

watchen198891

回复 gxbzjznn 的帖子. ]5 X  z" v1 G: q. A
+ t" c2 `0 ^( O2 A9 S4 e
一般测序前面的一段都是不正确的，所以你单独拿100bp长度的DNA去测序可能有点不太准确，为了确保正确最好连接在T载体上再去测序，估计这样要可靠一些。
. v$ k( K7 s' Z' |

gxbzjznn

回复 watchen198891 的帖子0 a: H& V; @& z1 y9 U
) J$ v* Z. {3 \, `9 W" x. _* t* J
但是拿到的这个短片段59bp测序结果去ncbi上比对也能跟我需要比对的目的序列比中

gxbzjznn

回复 watchen198891 的帖子( N4 `" K. Z% x% K2 C& D
; Y1 J+ j7 \1 }2 D; Z7 Q/ g& _( n
请问这个比对结果说服力强吗？可以用吗？因为不想连载体做克隆了

春玲子

回复 gxbzjznn 的帖子. ^5 P9 b, P9 f; ?: [
0 t5 {" K- p+ E/ h
你扩增出来的基因不是你的目的基因，结果不可靠。

watchen198891

回复 gxbzjznn 的帖子" a. N6 p1 f6 V7 [% [$ N
8 N3 H+ x1 e- J7 ?& g
不具备说服力，测序结果中正确的序列太短。

gxbzjznn

回复 春玲子 的帖子" Z( p8 @! s3 @8 @& S1 W, T2 |
: k5 K5 I, d0 x" m
怎么讲？

gxbzjznn

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; Y1 |; F( e- ^- G% a. E1 o5 l* e: P6 _$ u& N, m6 }7 G
太短？