细胞培养时支原体污染的一般情况及如何预防 - 实验室综合讨论区干细胞之家



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发表于 2009-6-17 20:38 |只看该作者 |倒序浏览 |打印

细胞株若受到细菌、真菌、支原体、或是特定病毒等之污染时，会严重的影响实验的结果。而细菌、真菌等之微生物污染时，较易自培养基等的外观变化察觉。但是若受到支原体之污染时，细胞之外观较无明显变化，但是其污染会造成细胞之生长速率缓慢、细胞产生病变之型态改变等等变化。& R: i8 b5 f, Z
6 b7 {, z$ k2 {7 X5 p- v9 j
各国细胞库支原体污染的统计表，如下：
国家　受支原体污染(%) 报告年度
USA－FDA 15 1993(past 30 years)7 e, ]7 `- K6 g5 o5 K$ B4 R/ h( n
USA－ATCC 15-20 1992
Japan－(IFO，RIKEN，JCR 80~30~22 1981 1987-19931998
Germany－DSM 36 1990-1994. E# w2 E% ?. @# y
Argentina 65 1987& Q  u$ a, D5 v$ v
Israel 32 1986-1993
China 95 1990

造成支原体高污染率的原因为： # H4 _* [- Z4 |, ?, }0 b) q" r$ g
1.支原体size 0.1~0.8 um，无细胞壁，可透过一般过滤膜（0.22-0.45 um） 6 c: R7 }7 E, j1 P% }1 Q
2.支原体污染时，没有明显的肉眼或一般光学显微镜可观察到的特征变化
3.过去缺乏简单、快速且可靠的检测方式
4.细胞流通间缺乏品管，造成实验室间的相互污染 - Z2 J. v/ G* a! L
5.研究或操作人员忽略污染问题 2 Q( G* [: f' T; v9 Y5 l1 w/ `9 y

而支原体污染了来源:
1. 已受污染的细胞
2. 操作人员的疏失 $ [, _4 [6 W+ D& N
3. 已受污染的培养基、血清 " }! d4 ~) r( s$ s8 I! O
4. 操作环境不良、实验器具不洁等 - F4 l8 V$ h" J, e& r+ t; u1 U

由于支原体为人体口腔中之正常菌丛，实验室之操作人员的污染亦可能为污染源，须十分注意。而万一细胞已受支原体污染时，最佳的处理原则为将细胞高压灭菌后丢弃，以免污染其它洁净的细胞株。但是若是坚持要作去除支原体污染，有以下几种方法，只不过结果会与原始的细胞特性有差异。
去除支原体污染：
1. 抗生素处理：BM-cyclin（Roche），MRA（mycoplasma removal agent，ICN），Ciprofloxcin（Bayer），Enrofloxacin（Bayer）
2. Nucleic acid metabolites：5-bromouracil，Hoechst 33258，bromodeoxyuridine
3. Anti-sera
预防与控制方面可从以下各点加强注意：
G 设备方面： " p7 ~% z. t. z7 y! D
1. 使用已作支原体测试ok之细胞株 - c6 i; Y. \# Q* A' c
2. 于另一隔离之区域操作未知是否有支原体污染之细胞
3. 使用不添加抗生素的培养基培养细胞 - Q( Y& E. X( D+ k) N
G 检测方面：定期以标准的支原体检测方法检测细胞、培养基、血清、ddH2O有否被支原体污染。
G 实验操作人员之无菌观念与无菌操作技术之要求
, B2 e7 j( A0 I# ~7 M7 m
. @0 y+ I2 j$ g
有关支原体污染之问题与回答：
o 应如何避免细胞污染？* i! U) S2 {( y2 ?1 v
细胞污染的种类可分成细菌、酵母菌、霉菌、病毒和支原体。主要的污染原因为无菌操作技术不当、操作室环境不佳、污染之血清和污染之细胞等。严格之无菌操作技术、清洁的环境、与品质良好之细胞来源和培养基配制是减低污染之最好方法。. `1 n& F% Z2 p1 e
o 如果细胞发生微生物污染时，应如何处理？
直接灭菌后丢弃之。3 [/ h, }0 B: M+ N
o 支原体 (mycoplasma) 污染的细胞，是否能以肉眼观察出异状？& [6 K' U2 b/ g' Q0 i" ?
不能。除极有经验之专家外，大多数遭受支原体污染的细胞株，无法以其外观分辨之。0 N( z- N9 {; G& V8 I  [
o 支原体污染会对细胞培养有何影响？0 Q  \9 k- B9 j# r9 @: W1 V4 |/ I5 x+ M
支原体污染几乎可影响所有细胞之生长参数，代谢及研究之任一数据。故进行实验前，必须确认细胞为 mycoplasma-free，实验结果之数据方有意义。( Q' y% q! u4 ~% w% F( T3 H
o 侦测出细胞株有支原体污染时，该如何处理？: i5 i/ k. o- |* D) I
直接灭菌后丢弃，以避免污染其它细胞株。 , b4 W. I0 W6 J+ Y- ]8 t+ g1 H
+ m, ]! J6 }6 k; F& Q

支原体之检测：
***********直接培养法 *************: D$ r" F* U( `' d  e' s# s
· 原理：直接培养支原体于培养基中，观察其生长及菌落生成。 7 R$ N( C1 ^6 w: z$ ?1 L3 o
· 特点：是目前最直接与灵敏之步骤，亦是用来评估其它侦测新步骤之标准步骤。
· 缺点：培养时间长，须3－5星期才能判断。有些支原体不能在培养基培养出来 (例如M. hyorhinis)。需同时培养支原体株作为正反应对照组，可能会造成污染。 8 @7 `" C& t! G; i( ]5 `( r9 |' |. ^
· 材枓：dextrose、L-arginine HCl、Difco PPLO broth (Difco 0554-17-1) horse serum、15% yeast extract solution (autoclaved)、Bacto agar、无菌有盖螺旋试管(autoclaved)、无菌培养皿﹙60x15mm﹚、L-玻棒、37℃培养箱、厌氧缸（厌氧缸长期培养易有污染，所以厌氧包应用无菌水，每次打开厌氧缸后，用70% ethanol擦拭内壁。） + E; a+ T+ V# ~! z5 J% _5 C  {8 E
· 培养基制备：基本配方为Difco PPLO broth(60%), 马血清(20%), 15% yeast extreat solution (10%), 10x stock solution (10%)。由于培养时间长，可加入penicillin(50u/ml)至10x stock solution或加入thallium acetate (1：2000)至培养基中以防止其它细菌污染。
· 10x stock solution (1 liter) ：称取50 g dextrose，10 g L-arginine HCl，溶于1 liter蒸馏水中。以0.22μm无菌过滤膜过滤灭菌。分装100 ml至瓶中，保存于 -70℃。 8 c5 W6 n, P# R
· 液体培养基 (1 liter) ：称取21 g之Difco PPLO broth，0.02 g phenol red 于600ml蒸馏水中，加热搅拌溶解之。灭菌121℃，15分钟。待温度降低至室温后，于无菌操作台内加入200ml马血清，100ml之15% yeast extract solution，及100ml解涷之10x stock solution，混合均匀后，分装至已灭菌之有盖螺旋试管中，10ml/管。保存于4℃，期限1个月。
· 固体培养基 (1 liter )：称取21 g之Difco PPLO broth，0.02 g phenol red，15g Bacto agar于600ml蒸馏水中，加热溶解之。灭菌121℃，15分钟。放在50℃水中浴中，待温度降低至50℃时，于无菌操作台内加入200ml马血清，100ml之15% yeast extract solution 及100ml解冻之10x stock solution，混合均匀后，倒入60x50㎜之无菌培养皿中，5ml/培养皿。保存于4℃，期限1个月。 6 I& q6 @9 d- E8 [2 O  @9 E: C0 t
步骤：
· 取1 ml细胞培养液或0.2ml细胞悬浮液，接种于液体培养基中，置于37℃培养二周，观察是否有混浊或是pH值改变之情形。培养一周及二周后，分别取0.1 ml液体培养液涂在agar plate上，将其倒放置于37℃厌氧箱培养，培养至少3星期，持续观察是否有支原体之菌落出现。
· 另取1 ml细胞培养液或0.2ml细胞悬浮液，涂抹在agar plate上，37℃厌氧培养3星期，持续观察是否支原体菌落出现。
· 另作正负反应对照组，正反应对照组为Acholeplasma laidlawii (ATCC 23206) 与M. arginini (ATCC 23838)。负反应对照组为待测细胞之新鲜培养基。 7 W  n, \2 C6 e& k  [4 F
结果判读：
· 支原体生长较慢，所以先在液体培养基培养1~2周增殖后，再培养于agar plate上。需至少培养3星期后，才可断定是否有支原体污染。所以整个测试需5个星期才知正确结果。   s3 m' g: |0 E  C
· 典型之支原体菌落类似荷包蛋(fried- egg like)，乃是由于支原体往agar下层生长所致，为圆形无色透明菌落，大小约10-55μm。但是并非所有的支原体皆为似荷包蛋菌落，有些是圆形菌落或是类似粘菌类形态（slime）。 0 T$ x3 o# H5 W3 i1 v
· 若要区分细胞或是气泡造成的类似菌落，可将其自agar plate上切下，重新培养于液体培养基中，培养一星期后再种入agar plate，若是细胞则不会生长。
" r' ?- U$ S4 e
DNA萤光染色法
· 原理︰利用萤光染剂（bisbenzimide, Hoechst 33258）侦测支原体污染。此染剂会结合到DNA之Adenosine-Thymidine (A-T) rich区域，因为支原体之DNA中A-T含量占多数（55～80%），所以可将其染色而侦测。被支原体污染之细胞经染色后，在细胞核外与细胞周围可看到许多大小均一之萤光小点，即为支原体之DNA，证明有支原体之污染。
· 测试步骤用间接步骤，将待测细胞悬浮液或细胞培养液接种于指示细胞培养液中（indicator cell，例如Vero cell or 3T6 cell），然后培养指示细胞再作萤光染色。正负反应对照组亦可以接种于indicator cell内作为对照。
· 待测细胞亦可作直接测试，但需为吸附型细胞，培养后直接作萤光染色。有些细胞易有萤光背景，而干扰结果判读，则建议使用接种于指示细胞之步骤。 4 \) K7 h1 t) N3 z) U1 P
· 特点︰简单、经济与灵敏，广泛使用，可作为例行之侦测步骤。可以侦测不易培养之支原体，例如M. hyorhinis，较直接培养法快，约一星期即可知道结果。
· 缺点：有时仍会有萤光背景，影响判读。
材料︰ 3 b: n* J+ z$ c% t+ _9 G. ^
· Hanks’ balanced salt solution without NaHCO3 or phenol red (HBSS, GibcoBRL 21250-014﹚、bisbenzimide (Hoechst No.33258, Sigma B-2883)、thimerosol (Sigma T-5125)、0.1M citric acid、02M disodium phosphate、glycerol、glacial acetic acid、methanol、strerile H2O、chamber slide (Nunc 177380)或chamber slide替代物：35 or 60mm sterile plate内放置无菌22x22mm盖玻片﹙浸于酒精内，使用前过火灭菌﹚，一般吸附型细胞均能吸附在盖玻片上。染色后取出盖玻片，细胞面朝下放在玻片上观察。
· Indicator cells: Vero (African green monkey kidney, ATCC CCL-81 or CCRC 60013) or 3T6(mouse fibroblast, ATCC CCL-96 or CCRC 60070)，细胞须先测试无污染。αMEM with 10鸖 ( medium for Vero cell)
配制试剂:
· 无菌HBSS︰配制Hanks’ balanced salt solution，以0.22mm无菌过滤膜过滤灭菌。勿用高压蒸汽灭菌。
· Hoechst 33258 stock solution（100X）︰称取5.0 mg bisbenzimide和10.0 mg thimersol溶于100 ml无菌HBSS，置于棕色瓶中，室温下以电磁搅拌器搅拌30分钟至完全溶解后，以1ml分装至1.5ml小离心管中，贮存于-20℃。
· Hoechst 33258 working reagent︰取1 ml Hoechst 33258 stock solution，加入sterile 100 ml HBSS中，室温下搅拌45分钟，置于棕色瓶中并以铝箔纸包覆，避免光照，贮存于4℃。 # ~' P5 J' H; @6 P5 I7 o
· mounting solution︰22.2 ml 0.1 M citric acid和27.8 ml 0.2 M Na2HPO4加入于50 ml glycerol中混合，以1 N NaOH调整pH至5.5（pH很重要），贮存于4℃。 ' Y. R% z1 E6 D+ F
· 固定溶液（fixative）︰冰醋酸与甲醇以1︰3之体积比例混合，使用前才配制。
步骤：
· 培养Vero细胞： Vero细胞可作长期培养或制作多个冷冻保存管，测试前解冻培养。测试前一周培养Vero细胞。 ' B$ I$ K0 [7 j* \
· 在接种测试样品前一日，以trypsin-EDTA溶液处理Vero细胞，制成细胞悬浮液，以1~2x10^4 cells／ml培养于chamber slide中，每个well加入1ml细胞悬浮液，于37℃, 5％CO2培养。隔日确定生长良好后，即可接种测试样品。 / y# ~3 D5 ?$ T4 H; Y+ x0 O5 `
· 接种测试样品：样品种类：1ml待测之培养基，1ml待测细胞培养液（可将细胞稍微刮下﹚，0.05~0.1ml冷冻管之细胞悬浮液。
· 将测试样品加入chamber slide内，培养5天后，进行Hoechst 33258的萤光染色观察。 * E& M1 J- C  I
· 以Acholeplasma laidlawii ATCC 23206 感染Vero细胞作为正反应对照组﹙或是已感染支原体之细胞培养液或冷冻细胞液﹚，负反应对照组为Vero cell之新鲜培养基( αMEM 10鸖)。
DNA萤光染色检测︰ , u" w2 I. J. S9 Q4 Y/ h
· 取出培养5日之Vero细胞，吸除培养液。于每个well中加入2 ml 1:3混合的冰醋酸/甲醇固定液，静置10 min后，吸除固定液。重复上述之步骤，风干10分钟。 7 U6 L' e3 k  t
· 于每个well中，加入1 ml Hoechst 33258 working solution，室温下静置30 min。
· 吸掉Hoechst 33258染液后，以无菌水洗涤3次，风干后加入1滴的mounting solution，并以盖玻片覆盖之。 9 l* g* j/ F& o8 P9 t
· 以100x-400x萤光显微镜观察。打开水银光源10 min后，以UV激发光束(330～380 nm)之滤光镜，观察细胞核外是否有蓝色萤光小点或是丝状点之萤光物产生。
结果判读︰) c% p0 f  ]8 i. }1 ?  S7 g
若有支原体污染，在Vero细胞核外与细胞表面会出现蓝色萤光小点或是丝状点。其形状一致，与细胞残片染成之不规则点状物不同。其萤光可维持数星期。* `- b$ Q  e+ e& H; T
图例 (A)为negative result : 萤光显微镜下，只观察到Vero细胞的细胞核，测试样品没有支原体的污染。(为positive result : 在Vero细胞核外与细胞表面会出现蓝色萤光小点和丝状点，表示测试样品有支原体的污染。