骨髓间充质干细胞向肝细胞诱导（转贴精华）

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5 C  Z$ [; G, u) E8 }# \) p8 P骨髓间充质干细胞向肝细胞诱导方案是什么，哪位大侠帮忙一下。$ U* W, z3 o0 F6 W
谢谢。
$ t% n; a" F- d. a/ \' _% ?$ b0 {; O' y# d: P
本贴回复转贴自dxy的精华贴

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1.常用的体外诱导方法是在体外培养的成体干细胞中加人入诱导因子。诱导因子包括各种能影响细胞分化的物质，如血清、糖分、维生素、以及各种蛋白因子等。
" W4 D$ s! P1 g6 G2.日本学者Oh等首先报道，高浓度肝细胞生长因子(HGF)体外诱导大鼠骨髓细胞分化为肝细胞，并表达CK8, CK18, ALB等。
6 C- W9 ]* K5 w3.2002年，Schwartz等将大鼠、小鼠和人的多能成体前体细胞(MAPC)接种到铺有基质明胶或纤维连结素的培养瓶中，用60％DMEM(低糖型)+ 2% FCS培养体系培养，并加入HGF和/或成纤维细胞生长因子-4(FGF-4)，在培养的第7天，MAPC分化为表达肝细胞核因子-3BETA,GATA-4 ,CK-19和AFP的上皮样细胞，在第14-28天，这些上皮样细胞表达CK-18, HNF-4和HNF-1 alfa。大约在第21天，CK-18和ALB染色阳性。这些上皮样细胞也具有肝细胞功能特征:分泌尿素和白蛋白，能摄取低密度脂蛋白并贮存糖原。
: n9 r# i* @( v% ?4.结果表明，用HGF和FGF-4在体外能将MAPC诱导分化成具有形态、表型和功能特征的肝细胞。实验表明，FGF-4单用可诱导肝细胞分化，用HGF处理的细胞分化程度更高。

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查过一些文献，诱导方案不一，大是大都是HGF,FGF,EGF这三种主要成分，加入的量和时间不同，有人设计出一种cocktail的诱导方案，也有人直接将所有因子加入诱导，真是不知道怎样评价那种方案好，哪种不好。( h& p0 i; O& y, T9 U
附上1篇文献关于诱导的。不知道为什么老说文件不存在。

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昨天试用了一种诱导方案诱导（向肝细胞），今天去看，细胞死了70％，全部悬浮起来，自己一想，MSC在变为肝细胞时需要时间，此时将适合MSC的DMEM换成适合肝细胞生长的诱导培养基应该是对MSC有影响的，应该采取逐步替代换液可能会好点，可是这种方法是别人用过的成功的方法，为什么他们就没有出现过这种情况，还是本身方法没问题，是我的实验出了问题呢？

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1.请问您的MSCs是培养多长时间的，您什么时候换成肝细胞诱导液进行培养的( q7 a' M0 m& F
2.一般说来，培养3-5代，待细胞融合80％左右，细胞活性很好，此时添加诱导剂较好
; l) U- W2 s5 Y) a" [6 d8 k3.诱导液的配制方法，已经诱导液的pH，pH值直接关系到细胞的存亡，一般说来，无菌基本不是问题, Z" Y# k' v; @# A& f6 [
4.一般无需逐步替代换液
! l# D5 H) H6 h) I1 i/ N- v  \5.应该不是您方法的问题，能把您诱导的具体方法发上来一起研究就可以更好的找出原因了，试验要尽量注意小细节问题！
: o7 a2 R. X% C2 L- Q/ N祝你好运！

chailh

我使用HGF20ng/ml，EGF10ng/ml联合诱导，10％FBS（Gibico特级胎牛血清），24小时后，一半细胞漂浮，48小时细胞死掉大半，镜下几乎不见典型贴壁细胞，真是心痛。% F$ _' q: Z+ i# t
疑问：% c1 E) d$ ^" Q) Y2 D; r. ^
1、细胞活性不好？! ?7 x; v( V* G5 u
代数是第4代，诱导前感觉形态尚可，密度为约70％
  P2 a( W% s1 g- M0 e* o9 e) B有人认为，诱导需要低营养、高细胞密度的条件，不知对不对？？, `2 ^7 Q9 \& e& L* A- f
2、诱导方案有问题？3 ?; l( Y1 n5 ?- J' N5 _5 _
各位有没有什么推荐？感觉上，很多国内文献的因子诱导方案似乎有待考证
/ H7 O* v9 k. \. f9 t初生牛犊，期待各位前辈的指点！
" ]2 X' W  E0 M8 Q图片我迟些时候上传上来。

chailh

1.您的细胞活性应该不是大问题，可能出在诱导培养液上
- m+ P2 t' I& j8 \5 N2 T/ N+ d) j2.诱导需要低营养、高细胞密度的条件，有一定的依据，很多人也是这样做得，效果还不错9 e! I3 O3 \8 L" J5 l
3.诱导液的pH值有一定的要求，一般要在7.2-7.4之间，配好溶液时测定，然后过滤除菌，最后取一部分加相应的因子就行了，4℃下保存的培养液保存最好不要1个月
. Q8 G' D* b4 U- q5 Y( b* K6 G4.您的诱导方案上基本没什么大问题，再试试吧

chailh

谢谢xn8476！4 ?+ K% T+ A1 o) L. r0 a4 q# P
我用的HGF/EGF储存液错误放在4度冰箱一月余，会不会跟这个有关阿，痛苦啊，一千多的东西，一时错失就.......呜呜4 w, _* u5 ~8 |; G. A, z
今天观察细胞：诱导第4天，细胞稀稀落落的，没有明显增多，宽大、分支多，还见到很多串珠、片状圆形 半透亮的东西，是不是感染支原体之类？图片还要等几天啊，拍照和培养不同地方。

chailh

我用的方案是：+ _7 C0 @( z$ l! m/ o) k& |
1 取第五代90％融合细胞9 y  A8 W1 u0 J1 G
2诱导培养基：HeptoZYMEZ－SFM＋HGF 20ng/ml+FGF-4 20ng/ml+EGF 20ng/ml. U: |* ~5 Y& F4 w; M
诱导24小时，细胞死了70％，48小时死的七七八八。
  q7 C( G+ t% u+ F' }7 |- z可是师兄做出来很好的，不知道什么原因。

chailh

请问ctyw708
) e. o# r! u9 E您是在原先的基础培养基－－DMEM上加入诱导因子吗？