骨髓间充质干细胞向肝细胞诱导（转贴精华）

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6 D% p& u4 i& r/ b# k3 E骨髓间充质干细胞向肝细胞诱导方案是什么，哪位大侠帮忙一下。
: @" M: s1 k% B+ L谢谢。
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1.常用的体外诱导方法是在体外培养的成体干细胞中加人入诱导因子。诱导因子包括各种能影响细胞分化的物质，如血清、糖分、维生素、以及各种蛋白因子等。
  m$ c/ g* v. K8 Q/ p$ c2.日本学者Oh等首先报道，高浓度肝细胞生长因子(HGF)体外诱导大鼠骨髓细胞分化为肝细胞，并表达CK8, CK18, ALB等。
3 ?% [* x& _' U, F; I2 J3 m) v3.2002年，Schwartz等将大鼠、小鼠和人的多能成体前体细胞(MAPC)接种到铺有基质明胶或纤维连结素的培养瓶中，用60％DMEM(低糖型)+ 2% FCS培养体系培养，并加入HGF和/或成纤维细胞生长因子-4(FGF-4)，在培养的第7天，MAPC分化为表达肝细胞核因子-3BETA,GATA-4 ,CK-19和AFP的上皮样细胞，在第14-28天，这些上皮样细胞表达CK-18, HNF-4和HNF-1 alfa。大约在第21天，CK-18和ALB染色阳性。这些上皮样细胞也具有肝细胞功能特征:分泌尿素和白蛋白，能摄取低密度脂蛋白并贮存糖原。
' ]# t) Q' Z, J0 \) n8 c9 n4.结果表明，用HGF和FGF-4在体外能将MAPC诱导分化成具有形态、表型和功能特征的肝细胞。实验表明，FGF-4单用可诱导肝细胞分化，用HGF处理的细胞分化程度更高。

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查过一些文献，诱导方案不一，大是大都是HGF,FGF,EGF这三种主要成分，加入的量和时间不同，有人设计出一种cocktail的诱导方案，也有人直接将所有因子加入诱导，真是不知道怎样评价那种方案好，哪种不好。* z% R( B4 |6 O) p1 D
附上1篇文献关于诱导的。不知道为什么老说文件不存在。

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昨天试用了一种诱导方案诱导（向肝细胞），今天去看，细胞死了70％，全部悬浮起来，自己一想，MSC在变为肝细胞时需要时间，此时将适合MSC的DMEM换成适合肝细胞生长的诱导培养基应该是对MSC有影响的，应该采取逐步替代换液可能会好点，可是这种方法是别人用过的成功的方法，为什么他们就没有出现过这种情况，还是本身方法没问题，是我的实验出了问题呢？

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1.请问您的MSCs是培养多长时间的，您什么时候换成肝细胞诱导液进行培养的. |0 o7 p+ [6 d9 n/ |( _6 \- L
2.一般说来，培养3-5代，待细胞融合80％左右，细胞活性很好，此时添加诱导剂较好  a; k: }: m0 ^' A# X; b
3.诱导液的配制方法，已经诱导液的pH，pH值直接关系到细胞的存亡，一般说来，无菌基本不是问题& i, I6 }7 Z' p1 ~( g
4.一般无需逐步替代换液5 f9 n) w3 `0 z/ _% N4 m; b
5.应该不是您方法的问题，能把您诱导的具体方法发上来一起研究就可以更好的找出原因了，试验要尽量注意小细节问题！' |" \) Z  |( K0 |+ @9 U
祝你好运！

chailh

我使用HGF20ng/ml，EGF10ng/ml联合诱导，10％FBS（Gibico特级胎牛血清），24小时后，一半细胞漂浮，48小时细胞死掉大半，镜下几乎不见典型贴壁细胞，真是心痛。
1 c5 A' N0 k3 I5 n8 G  [疑问：! T2 S( z/ H( u  ~- K8 G
1、细胞活性不好？/ j, o8 p( Y- \0 F
代数是第4代，诱导前感觉形态尚可，密度为约70％
! Z0 V; P  Q& T6 }" f) b有人认为，诱导需要低营养、高细胞密度的条件，不知对不对？？
$ y. K: ~: R/ b2、诱导方案有问题？# m" _, ^$ v+ |; x6 ?1 @4 l' z
各位有没有什么推荐？感觉上，很多国内文献的因子诱导方案似乎有待考证
9 p' F7 e. ?2 c0 ?$ I, V: I1 w初生牛犊，期待各位前辈的指点！  N4 W" q5 O1 a  U& B
图片我迟些时候上传上来。

chailh

1.您的细胞活性应该不是大问题，可能出在诱导培养液上/ M1 m8 M' @+ t! x6 V8 c& w
2.诱导需要低营养、高细胞密度的条件，有一定的依据，很多人也是这样做得，效果还不错
0 i  A# j& C1 H( m$ l$ X3.诱导液的pH值有一定的要求，一般要在7.2-7.4之间，配好溶液时测定，然后过滤除菌，最后取一部分加相应的因子就行了，4℃下保存的培养液保存最好不要1个月
6 c# f8 }. q2 V! I" }' ^% R: i4.您的诱导方案上基本没什么大问题，再试试吧

chailh

谢谢xn8476！
6 D6 f, @( |( v* b3 r$ w: H. b我用的HGF/EGF储存液错误放在4度冰箱一月余，会不会跟这个有关阿，痛苦啊，一千多的东西，一时错失就.......呜呜/ J' q5 _1 F0 \/ q
今天观察细胞：诱导第4天，细胞稀稀落落的，没有明显增多，宽大、分支多，还见到很多串珠、片状圆形 半透亮的东西，是不是感染支原体之类？图片还要等几天啊，拍照和培养不同地方。

chailh

我用的方案是：
/ E7 Q. z$ C+ y$ }( n4 ~+ m1 取第五代90％融合细胞7 p! m7 f$ w1 M; c
2诱导培养基：HeptoZYMEZ－SFM＋HGF 20ng/ml+FGF-4 20ng/ml+EGF 20ng/ml
; K$ o0 x3 j9 Z- P/ h+ b$ c诱导24小时，细胞死了70％，48小时死的七七八八。
4 W! B* K) t1 P4 c  @+ g可是师兄做出来很好的，不知道什么原因。

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请问ctyw708. d. [4 V# [) g/ S6 y$ ]
您是在原先的基础培养基－－DMEM上加入诱导因子吗？