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本帖最后由 泡沫清风 于 2009-8-17 15:56 编辑 7 b" n% h0 z- A2 z! N1 I
9 s3 d" R- S( C$ b; o; g
第三天中午，差不多复苏后50小时左右，观察细胞. k4 e- @+ [6 s0 f4 Z4 {
0 E! R6 K* E$ I# B3 y8 f( X/ Z4 H9 X& Q+ F
不同的实验室消化传代的方法不同，我的方法可供参考：- o+ ^( {" ~- ~& C
7 w) b: | M7 i% G' ~- t实验前准备：
/ I2 i* G7 G( {( I, O1 ?2 e（1）DMEM+10%FBS
6 A9 M3 b0 w( ?. K. x% P（2）PBS
* u, _# ]: u# Y; V( m2 m8 T（3）0.25%胰酶, |: J% B4 j9 g
（注：同样这些试剂要平衡到常温再做实验）
- a1 u- J/ i7 i9 R( W1 a5 y+ ^& v: s+ z3 Z
实验步骤：
+ a- G I$ O1 B$ l; ^5 V% n# T3 ]（1）弃去T75瓶中的原液。 ^: Y- K. O9 U; T9 r B
（2）加入5mlPBS洗一遍，洗去残留的血清。1 a0 G$ z% F7 m; q
（3）加入3ml胰酶，大概常温放置1-2min。9 \1 j2 h" S5 ]% O6 I$ a9 }
（4）加入6ml新鲜培养基中和胰酶，并轻轻吹打内壁上的细胞。
+ g$ }# z4 r7 r# u6 N& O8 i! g（5）将内壁上的细胞吹打下来后，充分吹打细胞液，使其成为单细胞悬液。不过也有老师和我说不成单细胞关系也不大，3.4个细胞成团没有关系。因人而异吧，呵呵。我一般吹打50-100下。自己看着办吧，也有人吹打5-10min。
( f; o9 X+ c' g; a, m& O（6）吹打成单细胞悬液后，转移到50ml离心管中。1000rpm 常温离心5min。# g2 ^- O7 M5 s. ?8 K. x! w
（7）离心期间另外准备两个T75瓶，加上原瓶，共三个T75培养瓶，分别向瓶中加入10ml新鲜培养基。离心后，用15ml新鲜培养基重悬。充分吹打后，平均转移至三个T75瓶中。混匀。
% S+ P+ u( D }0 e9 w! H7 @" a（8）放入温箱培养。7 d' _' U( M3 h1 m5 W& Y. ]4 Z. ]
(注：我一般一个T25瓶长到80%左右传到一个T75瓶。而一个T75瓶长到80%左右传三个T75瓶，也就是1：3传。) |
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发表于 2009-8-17 15:46
发表于 2009-8-17 17:04
