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本帖最后由 泡沫清风 于 2009-8-20 12:20 编辑 + a9 ~& T0 o! _8 a0 @
) g( R' ~# x- v5 M9 g2 d9 c铺皿后19小时左右，观察细胞密度：/ Z8 P7 ~: X- w/ K& B* s. s
" |! |1 {. v- y. s
# r0 D+ ~( m3 _5 h: p& R实验准备：% h2 t C9 f" Y% o9 j0 _
1、培养基：DMEM+10%FBS; ~4 E _/ i4 r1 v& e3 Z
2、lipofectamine 2000 （invitrogen）
' `: V; ~- D# b2 b( ~3、OPTI-MEM （GIBCO）* ]7 G1 L$ S# v
4、质粒9 N: J' f6 L# v# x5 q
两个目的质粒：MSCV-BCR/ABL-IRES-GFP
8 W) [# ?# W$ o! T' @) {) D3 ~ MSCV-IRES-GFP2 x! B" z% V, m; l. c- e
两个包装载体：pKat和pCMV-VSVG' @. l! M# R/ r, r4 V2 T
" n4 B& A; y, m% c* S5 z实验步骤：) M# y( e; @( T: d
1、弃去6个皿中旧培养基，各加入4ml新鲜培养基。5 F6 O! |' q n8 P
2、制备质粒-lipo 2000混合液：; e0 {* w1 F# h1 I7 p2 A
（一个10cm皿我用质粒的量是10ug，lipo2000的量是20ul，OPTI-MEM 1ml，6个皿中其中4个皿用来转染MSCV-BCR/ABL-IRES-GFP，另外两个皿用来转染MSCV-IRES-GFP作为对照）7 ? e; |# l$ A& Q1 w, O
* G; [; z7 @. j W' ^* @ y& ?
（a）取一个4mlEP，加入120ul lipo2000，再加入3ml OPTI-MEM，混匀，室温静止5min。（6个皿的量）
7 m4 W( t7 S% N/ s( ^ （b）取第二个4ml EP，加入MSCV-IRES-GFP 10ug，Kat和VSVG各5ug，加入1ml OPTI-MEM。（2个皿的量）" O1 k) u0 ]1 V, [1 p$ J9 t# x
（c）取第三个4ml EP，加入MSCV-BCR/ABL-IRES-GFP 20ug，Kat和VSVG各10ug，再加入2ml OPTI-MEM。 （4个皿的量）
8 l$ @( B0 N# {5 k, \ （d）取（a）中1ml于（b），其余2ml到（c），混匀，室温静止20min, {. [4 ^# k" E& F) n1 s
3、在1-4皿中加入（a）与（c）的混合液各1ml，5-6皿加入（a）与（b）的混合液各1ml，注意一滴一滴加入。这样每个皿都为5ml总体积。
& n6 Q: z1 M9 Y4 P2 s0 i4、放入温箱培养，到6小时时换液。 |
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