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本帖最后由 泡沫清风 于 2009-8-20 12:20 编辑 0 |" d. N# M+ {! i* l
( U- j5 g# z8 _3 e' G: q! H1 f
铺皿后19小时左右，观察细胞密度：
( {4 j& M. K& r B
/ Z# {' |( Z4 Q. j3 {
: j: L* u; h* u6 `) R) C& T实验准备：
# |8 x) I7 a7 ~. v, m: p6 L$ l1、培养基：DMEM+10%FBS
5 O' i0 k3 l+ J& D2、lipofectamine 2000 （invitrogen）
& L4 P( c& ]2 P' N7 U3、OPTI-MEM （GIBCO）
* Z! b8 r/ V; O2 s& v+ V* ]4、质粒- V; d8 C* A! i/ u L
两个目的质粒：MSCV-BCR/ABL-IRES-GFP
5 {" v7 R. X5 Y4 G' A, i MSCV-IRES-GFP
u1 l1 Q* `; D0 h7 j4 Q 两个包装载体：pKat和pCMV-VSVG
2 u, S! F# t* S; |. P
) K7 `& y) i6 d& K$ O实验步骤：2 u/ E/ }7 Q: u- z2 z! R* Q- g1 f7 E
1、弃去6个皿中旧培养基，各加入4ml新鲜培养基。
- t, S: J5 @! Y2、制备质粒-lipo 2000混合液：' N$ |! p* q, `; q$ i+ O) y% @9 R# s. M
（一个10cm皿我用质粒的量是10ug，lipo2000的量是20ul，OPTI-MEM 1ml，6个皿中其中4个皿用来转染MSCV-BCR/ABL-IRES-GFP，另外两个皿用来转染MSCV-IRES-GFP作为对照）
$ K9 V1 P4 W- p& h' V. M
4 T" J2 b( x: e* h5 l+ \" n ^ （a）取一个4mlEP，加入120ul lipo2000，再加入3ml OPTI-MEM，混匀，室温静止5min。（6个皿的量）
( \5 H$ }/ ^7 t' D3 G2 [' j. W （b）取第二个4ml EP，加入MSCV-IRES-GFP 10ug，Kat和VSVG各5ug，加入1ml OPTI-MEM。（2个皿的量）- c9 A1 Y& P v
（c）取第三个4ml EP，加入MSCV-BCR/ABL-IRES-GFP 20ug，Kat和VSVG各10ug，再加入2ml OPTI-MEM。 （4个皿的量）: s+ Z( ?6 a2 \ k2 h- U5 P
（d）取（a）中1ml于（b），其余2ml到（c），混匀，室温静止20min
# x: F [+ u. k) T2 M+ B, C3、在1-4皿中加入（a）与（c）的混合液各1ml，5-6皿加入（a）与（b）的混合液各1ml，注意一滴一滴加入。这样每个皿都为5ml总体积。$ C. N9 g7 }9 o
4、放入温箱培养，到6小时时换液。 |
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