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本帖最后由 泡沫清风 于 2009-8-20 12:20 编辑
8 b8 @) Z( b- Q2 m" ?; _7 f, } R: m# U. _2 B: C! p: t
铺皿后19小时左右，观察细胞密度：- n' v; v p" W( p% v% y
1 A6 L% Z7 N2 E, }0 c3 P& ^
. W% ?( i( |6 g实验准备：9 j6 B, F0 z. \: s4 d2 e
1、培养基：DMEM+10%FBS$ h! y2 O p) p. T! l9 e
2、lipofectamine 2000 （invitrogen）4 \2 Q* V/ D; K/ X8 t
3、OPTI-MEM （GIBCO）
5 u- N$ }2 P( S. d4、质粒* i3 j1 E7 x6 m: N, G+ c( x ~+ V
两个目的质粒：MSCV-BCR/ABL-IRES-GFP' b0 m( ^$ [# l- ]) g, Y$ Q
MSCV-IRES-GFP
# q j2 @" W5 B' i3 b! v0 H 两个包装载体：pKat和pCMV-VSVG& V' w' [1 |# ]% k7 M- V& k
8 D& n0 b6 j" r- D v6 Q4 v实验步骤：
8 a$ [- H/ w9 I1、弃去6个皿中旧培养基，各加入4ml新鲜培养基。
, A3 y- a, w' x* ?4 Q6 ]7 Z2、制备质粒-lipo 2000混合液：
7 h7 `$ E; ]+ Q7 z& v（一个10cm皿我用质粒的量是10ug，lipo2000的量是20ul，OPTI-MEM 1ml，6个皿中其中4个皿用来转染MSCV-BCR/ABL-IRES-GFP，另外两个皿用来转染MSCV-IRES-GFP作为对照）
: ]0 {. A; ^* A- a, r. ^5 D% Z) D% |3 U F7 {4 A0 {
（a）取一个4mlEP，加入120ul lipo2000，再加入3ml OPTI-MEM，混匀，室温静止5min。（6个皿的量）
- l, H7 q( |& V# q7 W9 t （b）取第二个4ml EP，加入MSCV-IRES-GFP 10ug，Kat和VSVG各5ug，加入1ml OPTI-MEM。（2个皿的量）
3 S5 ?! K5 b& B" ~8 E0 A7 } （c）取第三个4ml EP，加入MSCV-BCR/ABL-IRES-GFP 20ug，Kat和VSVG各10ug，再加入2ml OPTI-MEM。 （4个皿的量）
) n% f4 V5 n( z, _ （d）取（a）中1ml于（b），其余2ml到（c），混匀，室温静止20min9 Z2 E4 O6 g( j
3、在1-4皿中加入（a）与（c）的混合液各1ml，5-6皿加入（a）与（b）的混合液各1ml，注意一滴一滴加入。这样每个皿都为5ml总体积。
! [2 b- v+ J8 w4、放入温箱培养，到6小时时换液。 |
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