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本帖最后由 泡沫清风 于 2009-8-20 12:20 编辑
" _2 C9 M! a; M. w
8 U5 L/ _7 O- T" i4 y! r& d0 b: K铺皿后19小时左右，观察细胞密度：0 S% e y2 ~7 s% v( o# b9 |5 J
* B* S$ q/ m) W3 H9 |' B! D) {6 z& Z/ r
实验准备：5 O2 \; J$ L3 G( a4 ]
1、培养基：DMEM+10%FBS% ]/ Y ^% `! G& ^3 `
2、lipofectamine 2000 （invitrogen）" F9 q* ] h# [# Y" N
3、OPTI-MEM （GIBCO）2 ]2 f1 a4 ~! Z2 A; b/ @2 {/ Z
4、质粒
0 B( ^( _5 L1 ~1 Y1 C 两个目的质粒：MSCV-BCR/ABL-IRES-GFP
; `9 o8 s. { k; q/ } MSCV-IRES-GFP* m: G2 s8 C4 \* D
两个包装载体：pKat和pCMV-VSVG3 @0 s2 g: O) m% R
4 C. Y S8 Y' e; H- x
实验步骤：
7 n3 V$ @# \* r# G: y8 p1、弃去6个皿中旧培养基，各加入4ml新鲜培养基。5 j2 |1 t- p3 Y8 r: \& ]( P
2、制备质粒-lipo 2000混合液：+ Y( S, f( Y: V3 @
（一个10cm皿我用质粒的量是10ug，lipo2000的量是20ul，OPTI-MEM 1ml，6个皿中其中4个皿用来转染MSCV-BCR/ABL-IRES-GFP，另外两个皿用来转染MSCV-IRES-GFP作为对照）" v8 p' G6 H" w9 e! t
; [9 W7 i* C: e9 C5 C' i （a）取一个4mlEP，加入120ul lipo2000，再加入3ml OPTI-MEM，混匀，室温静止5min。（6个皿的量）
% x7 v2 z* J, {0 C+ v X/ X （b）取第二个4ml EP，加入MSCV-IRES-GFP 10ug，Kat和VSVG各5ug，加入1ml OPTI-MEM。（2个皿的量）* W9 |3 h# d; \0 P& b5 {
（c）取第三个4ml EP，加入MSCV-BCR/ABL-IRES-GFP 20ug，Kat和VSVG各10ug，再加入2ml OPTI-MEM。 （4个皿的量）
7 l9 p6 r5 {# i* ` （d）取（a）中1ml于（b），其余2ml到（c），混匀，室温静止20min
9 E- [. I; f* c# ]+ d" M* J, J3、在1-4皿中加入（a）与（c）的混合液各1ml，5-6皿加入（a）与（b）的混合液各1ml，注意一滴一滴加入。这样每个皿都为5ml总体积。. m" S& m- K4 S$ t0 @6 o* N
4、放入温箱培养，到6小时时换液。 |
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