全骨髓法培养的SD大鼠幼鼠的骨髓间充质干细胞,问题可能出在哪呢？

zlz2626

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第五天的  全骨髓提取法

zlz2626

上面是我用全骨髓法培养的SD大鼠幼鼠的 骨髓间充质干细胞   这是5天的  我是3天换液的  大家帮忙看看  感觉MSC  不是很多  其他细胞到不少     ！！2 G# h( n% K8 S
这个是我同时用PERCOLL  密度梯度法  一起做的   结果密度梯度法 提的细胞就是不贴壁  可用全骨髓提的道长了    因为我后期的实验对细胞的纯度要求很高   我怕全骨髓提的达不到我的要求        O/ s# C) y. ~4 q% N8 @7 c
密度梯度法细胞不贴壁的原因我分析了下可能有以下几点  " _! b- M# r$ h" `6 J# K0 K. M1 ?
1.就是PERCOLL  的浓度  我用的是1.077的  体积分数60%   难道是浓度不可以
9 E- z$ J6 ?0 b+ l2.就是离心这歩  我是2500转  25分钟   有没有可能对细胞造成损害不贴壁呢？$ G4 |' e: J$ z/ `1 T8 d) a
3.就是培养体系  我的培养基可能有问题  我用的是L-DMEM  加的10%的FBS 。不过全骨髓的 我也是用的相同的培养基  就长出来了  
5 R3 V2 s, S" P( T, F! n   暂时就能想到这么多了   那位战友 能帮忙分析下  问题可能出在哪呢？

饶冠华

- `( y8 ]* @2 U. {' j: R

- I+ E# b2 n9 {" M图片看上去怎么这么怪啊？ 为什么要用绿色背景啊？ 好难看~~  你为什么说觉得MSC很少呢？仅仅凭目测吗？还是你有染过MSC的marker??   你觉得那里面都有什么其他杂细胞呢？ 有没有依据？- h3 y* @3 x" Z. D' ?& ]$ X* a* A+ R

' ]/ E4 j3 t5 o  Z, [# |2 B这张图片看不太清楚，建议你用倒置相差显微镜照明场 再发上来看看

zlz2626

3# 饶冠华 9 d$ c0 y4 n  ]% B# E: R; T
$ ^! }* }( L3 I/ J8 s# b

, ]0 Z' s7 i% ]% }6 E- E3 O6 o还没做检查 ，我让我们实验室的一个老师帮忙看了下  她说从形态上看 有BMSC  具体她也说不清    我也是头一次见到我养的东西  所以我也不知道  想请战友们帮忙看下了   其实用全骨髓法提也是战友们的建议  我就试了下  我原本是想用密度梯度法提的 可密度梯度法 没有出结果  而全骨髓法到长出来了  就是上面这张图   7 C. r: ~# R$ u& ~4 W* ^
至于为什么用绿色   呵呵  因为我们的实验室的倒置显微镜就只有绿光的  所以就用了

饶冠华

0 I) \  B/ F3 V# E6 s, M
( V1 d) G5 {% J' r5 M& }
4# zlz2626
$ ?, d; N: K. Z6 k( I$ e不可能吧，所有显微镜都有明场啊  你把滤光片调到没有颜色的那个档位  你去问问你们师兄师姐吧
; @( k! j! n5 t另外，你把细胞传1~2代  杂细胞就应该会消失的.  另外建议你搜索几张MSC的图片看看，就心里有底了
3 I! B! N: ^7 A0 ]( V% Y

li-baby

密度梯度法细胞不贴壁，离心转速有点高吧，我们是1800转还算可以。

zlz2626

5# 饶冠华
( R* Y: w+ t0 L1 I+ C( C+ y
# ~) ^3 J  f$ z$ r: i
: G, `% {% N6 ]/ ?谢谢了  我试试

zlz2626

6# li-baby
/ R2 G! w( j. z" L( O+ M) G4 J! h1 H+ G$ \; o6 l
0 I5 y$ U' Z, p2 Y
能把你的整个过程详细说下嘛  包括PERCOLL的配制 ， 十分感谢

02402122

我不建议使用PERCOLL+ I6 Z" `' L6 H7 R
全骨髓贴壁就满好的
/ Y! \2 p# u$ S. K  q6 P0 ?% s当然这是我的意见
% B) Y4 `  `& P' K- }4 A5 T8 M传三至四代细胞就能纯化很多5 ^6 j5 e$ @" f# {' X
不行做个鉴定吧

凤仪飘雪

上面是我用全骨髓法培养的SD大鼠幼鼠的 骨髓间充质干细胞   这是5天的  我是3天换液的  大家帮忙看看  感觉 ...
# E8 y8 p  ^: T* dzlz2626 发表于 2009-8-24 19:07

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  P1 r3 o: H' {
    percoll应该用1073的才对吧？还有转速的确太高了，我平常都用1200~1500就足以分层了，20min就可以。不过经过比较我还是觉得全骨髓法效果比较好，用分离液细胞生长非常慢而且状态也不好。