全骨髓法培养的SD大鼠幼鼠的骨髓间充质干细胞,问题可能出在哪呢？

zlz2626

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& A8 O+ C7 m0 ?第五天的  全骨髓提取法

zlz2626

上面是我用全骨髓法培养的SD大鼠幼鼠的 骨髓间充质干细胞   这是5天的  我是3天换液的  大家帮忙看看  感觉MSC  不是很多  其他细胞到不少     ！！' e, S# z" @- N) h) n' ^2 c5 B4 }
这个是我同时用PERCOLL  密度梯度法  一起做的   结果密度梯度法 提的细胞就是不贴壁  可用全骨髓提的道长了    因为我后期的实验对细胞的纯度要求很高   我怕全骨髓提的达不到我的要求      
2 P2 w; Q! L/ k! h9 J& ?4 O密度梯度法细胞不贴壁的原因我分析了下可能有以下几点  0 j3 p# ~' x  w' \
1.就是PERCOLL  的浓度  我用的是1.077的  体积分数60%   难道是浓度不可以
( m1 {7 }' G) r0 W8 Z2.就是离心这歩  我是2500转  25分钟   有没有可能对细胞造成损害不贴壁呢？' l7 N+ j: u- @1 e1 d7 ]
3.就是培养体系  我的培养基可能有问题  我用的是L-DMEM  加的10%的FBS 。不过全骨髓的 我也是用的相同的培养基  就长出来了  
' V0 h! D& j+ G: R* l7 B   暂时就能想到这么多了   那位战友 能帮忙分析下  问题可能出在哪呢？

饶冠华

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图片看上去怎么这么怪啊？ 为什么要用绿色背景啊？ 好难看~~  你为什么说觉得MSC很少呢？仅仅凭目测吗？还是你有染过MSC的marker??   你觉得那里面都有什么其他杂细胞呢？ 有没有依据？* D! Q  P! |7 `& R
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这张图片看不太清楚，建议你用倒置相差显微镜照明场 再发上来看看

zlz2626

3# 饶冠华
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# v2 r) k5 ^  j' j# y% L
/ x" M/ U2 @4 ^5 K还没做检查 ，我让我们实验室的一个老师帮忙看了下  她说从形态上看 有BMSC  具体她也说不清    我也是头一次见到我养的东西  所以我也不知道  想请战友们帮忙看下了   其实用全骨髓法提也是战友们的建议  我就试了下  我原本是想用密度梯度法提的 可密度梯度法 没有出结果  而全骨髓法到长出来了  就是上面这张图   : V* K: T. m' X: B
至于为什么用绿色   呵呵  因为我们的实验室的倒置显微镜就只有绿光的  所以就用了

饶冠华

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4# zlz2626
: Q: W- a$ @! ]不可能吧，所有显微镜都有明场啊  你把滤光片调到没有颜色的那个档位  你去问问你们师兄师姐吧( v/ f" M! h/ Z. K* ^
另外，你把细胞传1~2代  杂细胞就应该会消失的.  另外建议你搜索几张MSC的图片看看，就心里有底了
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li-baby

密度梯度法细胞不贴壁，离心转速有点高吧，我们是1800转还算可以。

zlz2626

5# 饶冠华 1 \' u+ _9 u+ f4 q4 B$ R

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谢谢了  我试试

zlz2626

6# li-baby
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能把你的整个过程详细说下嘛  包括PERCOLL的配制 ， 十分感谢

02402122

我不建议使用PERCOLL
' k% Y; O7 V$ j1 D) k. K3 Y全骨髓贴壁就满好的$ y, _) u$ s" n' Z' E
当然这是我的意见
$ [( K, O  A; ~1 J! {( y" Y传三至四代细胞就能纯化很多
3 L/ ^% y' ^$ T3 Q不行做个鉴定吧

凤仪飘雪

上面是我用全骨髓法培养的SD大鼠幼鼠的 骨髓间充质干细胞   这是5天的  我是3天换液的  大家帮忙看看  感觉 ...5 S  ]2 [/ V* J3 @0 K+ S: v  Q
zlz2626 发表于 2009-8-24 19:07

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    percoll应该用1073的才对吧？还有转速的确太高了，我平常都用1200~1500就足以分层了，20min就可以。不过经过比较我还是觉得全骨髓法效果比较好，用分离液细胞生长非常慢而且状态也不好。