请教一下给为前辈一些关于羊膜干细胞培养的问题，望指教

2357710447

羊膜干细胞用什么方法培养，培养贴壁法or消化法？    个人认为消化法好一点，用那种类型的酶消化、浓度、时间、比例等，希望前辈们多多指教，急需！

fenglinzhu

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; F( a+ k" m4 X* d
9 R8 v$ K6 C# s' t# ^1 M( E, ~# q我做过羊膜间充质干细胞的培养，消化法比较容易操作

wzs1985

消化羊膜：
# z$ Y; K( O. f$ t; T; f1）        37℃水浴预热胰蛋白酶/EDTA。
1 G0 {( q+ q% C$ i" t& w2）        将羊膜置于200ml cold PBS洗涤2-3次。
" _2 M8 D6 M6 p* I3）        羊膜分为3块，转移到3个新的50ml离心管，用20ml 0.05%胰蛋白酶/EDTA在37℃水浴温和震荡消化羊膜20分钟。倒掉消化液。
$ ]. i/ H7 l! y. w% ^+ Z& u4）        分为3组：40ml 0.05%胰蛋白酶/EDTA37℃水浴温和100rpm震荡，第1组羊膜40min*2次；第2组羊膜20min*4次；第3组羊膜30min*3次。
+ v, A/ x' F/ `: t- @. u5）        向第一次消化液中加入2倍体积的DMEM/F12完全培养基，1000 rpm离心5分钟。10ml DMEM/F12完全培养基重悬细胞沉淀，充分吹散细胞团，100-μm细胞筛过滤。1000 rpm离心5分钟，DMEM/F12完全培养基重悬细胞。. @6 E; m+ z3 c/ Y
6）        同样处理第二、三次消化液。每组每次的消化液不合并。! }$ R4 G$ t6 }* k. Q' L

3 g* ^3 f( a9 J仅供参考。

2357710447

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. Z, P* U1 h" X% \8 Q
% ^) }8 t# A+ R. G" j, R3 y$ X能讲一下具体的消化方法吗？  感谢了

2357710447

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* a% j9 _( Y% n# p0 B
+ ^8 ]- n4 c  d# f) d感谢了      但是我觉得用姨酶来消化次数和时间太长了    现在大部分好像都是用一型胶原酶   

fenglinzhu

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. a7 E! c6 `2 B6 U! q* b
- F  o5 B) F# q9 ^% T' b3 O把羊膜剪成0.2~0.5平方mm的小块置玻璃皿，加10ml0.05%胰酶，搅拌均匀后置37℃消化15分钟后取出搅拌均匀，再消化15分钟。( b8 _8 {& q/ W$ [
200目筛网过滤，并用PBS充分冲洗羊膜组织块。
) p% k/ j! s* L1 f+ o收集悬液，离心所得的细胞即为包含羊膜间充质干细胞的细胞群体，可直接冻存，也可直接用于培养

fenglinzhu

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( x) \& c& H7 J哦，对了，200目筛网过滤之前先用血清终止消化

2357710447

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1 R( i3 D/ T; H  T
5 T0 l  v; B) h这样消化下来不会有一些上皮细胞之类的杂细胞吗？消化的时候用50ml的离心管可以不，因为这样方便终止消化，离心管也好操作一些；终止消化可以用生理盐水将它稀释不？因为没有血清，过滤的时候可以用100目的滤网过滤吗，感觉那个过滤效果会好一些

2357710447

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6 s' ~( ^: a, H7 d# o" a7 _( P  C大概姨酶和羊膜组织块的比例是多少比多少来消化，消化效果好些，

fenglinzhu

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+ O- ^. {- M- H3 T  Q
会有一定的杂细胞，不管你用什么方法培养都会有一定的杂细胞啊，但杂细胞和间充干贴壁程度不同，贴壁时间不同，在培养基中生长情况不同，培养几代后就比较纯了。每次传代消化的时候那种难消化下来的细胞就放弃，这样可以提高纯度。胰酶能够淹没组织块即可，没有特定要求多少比例消化。100目也可以用啊，就是过滤起来比较慢。终止消化可以用含血清的完全培养基啊，稍微多加点就好了。用50ml离心管不是不可以，只是用50ml离心管可能比较浪费胰酶，不容易完全浸泡到嘛。