请教一下给为前辈一些关于羊膜干细胞培养的问题，望指教

2357710447

羊膜干细胞用什么方法培养，培养贴壁法or消化法？    个人认为消化法好一点，用那种类型的酶消化、浓度、时间、比例等，希望前辈们多多指教，急需！

fenglinzhu

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/ x% b! f& x/ o2 o0 a我做过羊膜间充质干细胞的培养，消化法比较容易操作

wzs1985

消化羊膜：. ]3 S* H& P& B; K
1）        37℃水浴预热胰蛋白酶/EDTA。, Z  a4 v; @8 u" G9 }5 G; \
2）        将羊膜置于200ml cold PBS洗涤2-3次。  f# Z- P7 I8 N/ a% K$ g2 y4 D
3）        羊膜分为3块，转移到3个新的50ml离心管，用20ml 0.05%胰蛋白酶/EDTA在37℃水浴温和震荡消化羊膜20分钟。倒掉消化液。' u- B2 w6 ?* e$ @/ }6 y" Q
4）        分为3组：40ml 0.05%胰蛋白酶/EDTA37℃水浴温和100rpm震荡，第1组羊膜40min*2次；第2组羊膜20min*4次；第3组羊膜30min*3次。% J7 {& Y; d' c4 n5 ?
5）        向第一次消化液中加入2倍体积的DMEM/F12完全培养基，1000 rpm离心5分钟。10ml DMEM/F12完全培养基重悬细胞沉淀，充分吹散细胞团，100-μm细胞筛过滤。1000 rpm离心5分钟，DMEM/F12完全培养基重悬细胞。
6 d$ n. u5 I% T6）        同样处理第二、三次消化液。每组每次的消化液不合并。) q; S, ~6 k8 m3 f" c  b9 x
0 O0 S. S$ i1 ]& J5 j
仅供参考。

2357710447

回复 fenglinzhu 的帖子+ u. x6 ?, e0 f! F* O

" w6 p. u. A2 @1 N" k能讲一下具体的消化方法吗？  感谢了

2357710447

回复 wzs1985 的帖子  R* F4 ?* V8 T# O+ `1 c2 l* z

. J2 V' u+ D( ^* k) o; l$ X感谢了      但是我觉得用姨酶来消化次数和时间太长了    现在大部分好像都是用一型胶原酶   

fenglinzhu

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: C$ T' n7 E4 [3 B/ R
4 B9 w8 f0 s1 E" I2 p5 t7 [把羊膜剪成0.2~0.5平方mm的小块置玻璃皿，加10ml0.05%胰酶，搅拌均匀后置37℃消化15分钟后取出搅拌均匀，再消化15分钟。
4 [# M. _- ^+ o' S+ Y* L200目筛网过滤，并用PBS充分冲洗羊膜组织块。
  r+ a; S  ]) U, [' E3 l  o& t收集悬液，离心所得的细胞即为包含羊膜间充质干细胞的细胞群体，可直接冻存，也可直接用于培养

fenglinzhu

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' [( T+ d# V) @7 n$ K. u* W" r  B% L
哦，对了，200目筛网过滤之前先用血清终止消化

2357710447

回复 fenglinzhu 的帖子" I7 m% n, u& w+ r. }
. I# }5 b! t4 F! Q4 P
这样消化下来不会有一些上皮细胞之类的杂细胞吗？消化的时候用50ml的离心管可以不，因为这样方便终止消化，离心管也好操作一些；终止消化可以用生理盐水将它稀释不？因为没有血清，过滤的时候可以用100目的滤网过滤吗，感觉那个过滤效果会好一些

2357710447

回复 fenglinzhu 的帖子" c6 O8 |7 K% {! k4 {- f; f. H7 j4 j
! u' g4 I4 e+ j, Q9 Z
大概姨酶和羊膜组织块的比例是多少比多少来消化，消化效果好些，

fenglinzhu

回复 2357710447 的帖子9 p0 b2 B* M" {- Z

3 ]1 s$ b: Q( M9 M会有一定的杂细胞，不管你用什么方法培养都会有一定的杂细胞啊，但杂细胞和间充干贴壁程度不同，贴壁时间不同，在培养基中生长情况不同，培养几代后就比较纯了。每次传代消化的时候那种难消化下来的细胞就放弃，这样可以提高纯度。胰酶能够淹没组织块即可，没有特定要求多少比例消化。100目也可以用啊，就是过滤起来比较慢。终止消化可以用含血清的完全培养基啊，稍微多加点就好了。用50ml离心管不是不可以，只是用50ml离心管可能比较浪费胰酶，不容易完全浸泡到嘛。