请教一下给为前辈一些关于羊膜干细胞培养的问题，望指教

2357710447

羊膜干细胞用什么方法培养，培养贴壁法or消化法？    个人认为消化法好一点，用那种类型的酶消化、浓度、时间、比例等，希望前辈们多多指教，急需！

fenglinzhu

回复 2357710447 的帖子
  E+ I" q' F% U& K
4 E9 r: k5 S! N5 C) x我做过羊膜间充质干细胞的培养，消化法比较容易操作

wzs1985

消化羊膜：
4 Q1 }4 ~6 Z# r  I! P( R1）        37℃水浴预热胰蛋白酶/EDTA。
" c/ l- s! u5 H: J' h; ?% n% ~1 g2）        将羊膜置于200ml cold PBS洗涤2-3次。, @7 K1 C3 {' |
3）        羊膜分为3块，转移到3个新的50ml离心管，用20ml 0.05%胰蛋白酶/EDTA在37℃水浴温和震荡消化羊膜20分钟。倒掉消化液。
3 r- V1 h4 W& w( c8 Q4）        分为3组：40ml 0.05%胰蛋白酶/EDTA37℃水浴温和100rpm震荡，第1组羊膜40min*2次；第2组羊膜20min*4次；第3组羊膜30min*3次。
% u+ ]) g! m3 _0 J# A+ @" P: q5）        向第一次消化液中加入2倍体积的DMEM/F12完全培养基，1000 rpm离心5分钟。10ml DMEM/F12完全培养基重悬细胞沉淀，充分吹散细胞团，100-μm细胞筛过滤。1000 rpm离心5分钟，DMEM/F12完全培养基重悬细胞。
/ P8 `! ?4 B/ j3 ^. ?  b: X6）        同样处理第二、三次消化液。每组每次的消化液不合并。5 l0 K( c9 E) M! A. e9 r
. t! T! a! e  p( v, H4 y0 p
仅供参考。

2357710447

回复 fenglinzhu 的帖子
, d5 m. w0 v1 c/ o5 l4 ?  W1 n( [% e2 }; W$ V' ~5 e0 a
能讲一下具体的消化方法吗？  感谢了

2357710447

回复 wzs1985 的帖子
- G: ^# c  ~; t' |+ ?( \8 b7 b
+ f6 E/ G# M! e8 K/ C  }6 @感谢了      但是我觉得用姨酶来消化次数和时间太长了    现在大部分好像都是用一型胶原酶   

fenglinzhu

回复 2357710447 的帖子
# \0 R( a5 t) {. @( r0 `# L7 A% [
5 E6 [6 A" E" W/ B把羊膜剪成0.2~0.5平方mm的小块置玻璃皿，加10ml0.05%胰酶，搅拌均匀后置37℃消化15分钟后取出搅拌均匀，再消化15分钟。3 v1 Y! A2 {& i3 w6 ^
200目筛网过滤，并用PBS充分冲洗羊膜组织块。
1 [2 {5 p; V6 Y. ~1 r收集悬液，离心所得的细胞即为包含羊膜间充质干细胞的细胞群体，可直接冻存，也可直接用于培养

fenglinzhu

回复 fenglinzhu 的帖子3 x3 d1 j" D/ a; g3 C5 q& X

. U5 ~5 M4 s+ N' B' B哦，对了，200目筛网过滤之前先用血清终止消化

2357710447

回复 fenglinzhu 的帖子
9 F4 W  U+ M* v2 U& Z2 [$ h4 a7 H
# |* N! D) m; @& n- F6 ^; k% a这样消化下来不会有一些上皮细胞之类的杂细胞吗？消化的时候用50ml的离心管可以不，因为这样方便终止消化，离心管也好操作一些；终止消化可以用生理盐水将它稀释不？因为没有血清，过滤的时候可以用100目的滤网过滤吗，感觉那个过滤效果会好一些

2357710447

回复 fenglinzhu 的帖子
4 d7 W" M1 V' c7 w, z$ ?
! u5 {$ j- j* A5 p( I) w- ^$ A大概姨酶和羊膜组织块的比例是多少比多少来消化，消化效果好些，

fenglinzhu

回复 2357710447 的帖子
! I! w0 k0 Z5 V( K+ K; I
: _+ u+ M$ a" V. j" B7 z会有一定的杂细胞，不管你用什么方法培养都会有一定的杂细胞啊，但杂细胞和间充干贴壁程度不同，贴壁时间不同，在培养基中生长情况不同，培养几代后就比较纯了。每次传代消化的时候那种难消化下来的细胞就放弃，这样可以提高纯度。胰酶能够淹没组织块即可，没有特定要求多少比例消化。100目也可以用啊，就是过滤起来比较慢。终止消化可以用含血清的完全培养基啊，稍微多加点就好了。用50ml离心管不是不可以，只是用50ml离心管可能比较浪费胰酶，不容易完全浸泡到嘛。