请教一下给为前辈一些关于羊膜干细胞培养的问题，望指教

2357710447

羊膜干细胞用什么方法培养，培养贴壁法or消化法？    个人认为消化法好一点，用那种类型的酶消化、浓度、时间、比例等，希望前辈们多多指教，急需！

fenglinzhu

回复 2357710447 的帖子, {) j. l8 h8 O! O
" H; F; a! A3 g6 |- m4 }* g  [
我做过羊膜间充质干细胞的培养，消化法比较容易操作

wzs1985

消化羊膜：
8 j# I$ K# z1 O1）        37℃水浴预热胰蛋白酶/EDTA。1 p% b2 r  X1 l8 ?" x' R
2）        将羊膜置于200ml cold PBS洗涤2-3次。
9 Y! c( e- k7 N" f3）        羊膜分为3块，转移到3个新的50ml离心管，用20ml 0.05%胰蛋白酶/EDTA在37℃水浴温和震荡消化羊膜20分钟。倒掉消化液。: c4 h" o; J1 Y- l, S: x, S" o8 n
4）        分为3组：40ml 0.05%胰蛋白酶/EDTA37℃水浴温和100rpm震荡，第1组羊膜40min*2次；第2组羊膜20min*4次；第3组羊膜30min*3次。3 _+ _# o  s7 I! F  U
5）        向第一次消化液中加入2倍体积的DMEM/F12完全培养基，1000 rpm离心5分钟。10ml DMEM/F12完全培养基重悬细胞沉淀，充分吹散细胞团，100-μm细胞筛过滤。1000 rpm离心5分钟，DMEM/F12完全培养基重悬细胞。+ Q$ S  P. j+ j, d/ Y' C
6）        同样处理第二、三次消化液。每组每次的消化液不合并。
! M5 C( X2 N. F; z- j: _/ U4 H0 v. K$ G) _5 H( M
仅供参考。

2357710447

回复 fenglinzhu 的帖子
: a5 k  q* m7 V. K% \4 N
/ d$ K3 M) D* N; s5 @+ m能讲一下具体的消化方法吗？  感谢了

2357710447

回复 wzs1985 的帖子
" l. i( G, t7 R1 G7 W, g, s3 J# n7 g' O1 y+ t9 S
感谢了      但是我觉得用姨酶来消化次数和时间太长了    现在大部分好像都是用一型胶原酶   

fenglinzhu

回复 2357710447 的帖子
. P* R# X  v# K# p
! e4 u3 o! O+ g; n把羊膜剪成0.2~0.5平方mm的小块置玻璃皿，加10ml0.05%胰酶，搅拌均匀后置37℃消化15分钟后取出搅拌均匀，再消化15分钟。$ @9 I8 h# o' [! v
200目筛网过滤，并用PBS充分冲洗羊膜组织块。
( _$ l+ m! u5 @5 W' g: h3 m8 ?8 B) [收集悬液，离心所得的细胞即为包含羊膜间充质干细胞的细胞群体，可直接冻存，也可直接用于培养

fenglinzhu

回复 fenglinzhu 的帖子
0 l- U3 r+ X* P/ l$ {" S1 L& e6 \5 y0 g
哦，对了，200目筛网过滤之前先用血清终止消化

2357710447

回复 fenglinzhu 的帖子
' W+ A# R. X* @# @$ e
" t3 U' N  w) l$ J这样消化下来不会有一些上皮细胞之类的杂细胞吗？消化的时候用50ml的离心管可以不，因为这样方便终止消化，离心管也好操作一些；终止消化可以用生理盐水将它稀释不？因为没有血清，过滤的时候可以用100目的滤网过滤吗，感觉那个过滤效果会好一些

2357710447

回复 fenglinzhu 的帖子  \- E. |7 f  O" @* o) q
  f& }: c% f' y  ?! z9 {
大概姨酶和羊膜组织块的比例是多少比多少来消化，消化效果好些，

fenglinzhu

回复 2357710447 的帖子3 e# u0 j; Z  h8 u+ }7 D

, P8 z6 _; ?# {9 Q1 D' t% E; ?: A会有一定的杂细胞，不管你用什么方法培养都会有一定的杂细胞啊，但杂细胞和间充干贴壁程度不同，贴壁时间不同，在培养基中生长情况不同，培养几代后就比较纯了。每次传代消化的时候那种难消化下来的细胞就放弃，这样可以提高纯度。胰酶能够淹没组织块即可，没有特定要求多少比例消化。100目也可以用啊，就是过滤起来比较慢。终止消化可以用含血清的完全培养基啊，稍微多加点就好了。用50ml离心管不是不可以，只是用50ml离心管可能比较浪费胰酶，不容易完全浸泡到嘛。