如何用PCR扩增长的片段

julia20

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. U: z% T% H1 S( f" ^. O5 X2 \8 p
9 ], d0 n' _' I1 H长片断是在基因组或者是逆转录文库里面是什么意思? 这些不好做, 那在其他什么情况好做呢? 谢谢!

chenhuachen

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9 H& [2 _& t% P$ L! b9 d* }5 y; c
4 d6 N: Z# d5 D7 I" X* g  N你好，想问一下第三条中“逆转录文库”指的是不是cDNA？

exin11

学习了

yueyongheng

个人认为TOYOBO公司的PCR酶系列很不错，尤其是KOD FX 。
; W9 I2 r; d& ^) [/ U! ^) r: T+ o普通 PCR反应：
6 a. I8 U, S& j  x2 h' q" kTaq DNA Polymerase " O( v8 {6 ~, G6 x9 b1 l% M1 c3 }
rTth DNA Polymerase
' x& @0 P3 [/ Y; `$ g0 f' o高效率 PCR反应：
! U/ w/ H: K7 G- bBlend Taq 7 O9 b! }* ~% _- E; p5 i" w6 R. D
Blend Taq Taq-Plus Plus-
# f5 i2 c9 w2 }) A8 ^: H7 XKOD Dash (LDP LDP-101)- z4 u: ^+ r$ W: X
KOD KOD-Plus Plus-
' v% T. d$ E1 [; I9 Y. C+ oKOD KOD-Plus Plus-Ver.2
4 |5 ~) N) v6 r- C. t6 P7 t1 R; yKOD FX , H' J' Y" [; Y0 q+ |! v
高保真 PCR反应：- a" N7 y8 J% D2 q0 {
KOD DNA Polymerase% R7 g7 V. j) ~  F! \8 \
KOD KOD-Plus Plus- 8 ~& w% |) w$ R3 k5 z6 x& ]7 d# B  o
KOD KOD-Plus Plus-Ver.2 $ G6 w0 z; `+ m5 `% ~$ T% _
KOD FX
# z) [1 v) p$ {5 B长片段 PCR反应：
5 }; V3 l$ a* ?3 ]Blend Taq Taq
  [% V. K. \4 D- p" ZBlend Taq Taq-Plus Plus-/ S( {+ _% @5 U* O& l2 |
KOD Dash ) W- X6 M/ t3 F/ r* s, n
KOD FX

weiyepan

回复 3# hawkyiger
; D- Y# T! O$ C2 b1 P另外拍一下hawkyiger的砖，PCR的引物不是看长度论退火的：
; f& a: R5 |3 ?$ A) p& Y+ H7 Y首先，引物设计推荐使用Primer Premer 5，直接算引物温度，算出来是比较准的，实际做的时候还可以提高1~2度，有时候引物就算20多个碱基，但是Tm才不到60度，是要看GC含量的；/ W2 n6 e& w4 @
第二，并不是说TM要在60~68之间的最好，其实如果能拿到短引物，特异性比较高的，就算50多度也是很理想的。有人说长引物特异性高，在我看来这是不对的。长引物更容易引起错配，大家可以自己去想想为什么。错配是可以在Primer Premer 5里面找出来的，如果算出来的自由能>20，那么这个引物已经很难做了，如果自由能>30，我建议重新设引物算了；/ l6 u7 @6 U6 i- s4 |+ q( a
第三，如果你的长片断是在基因组或者是逆转录文库里面，我建议就不用做了，因为能扩出来正确的几率微乎其微，还是去找模板实际。这不是酶和引物可以解决的问题。

weiyepan

如果条件比较好的，强烈推荐使用NEB的Phusion酶，1分钟4kb，扩30循环可以50%以上克隆无突变，扩出来片断又浓又干净，本人亲身验证扩增13kb条带，又快又好用；* Q% N9 k7 i7 h% C
如果条件不是太好，可以用我们公司的HSHF，就是扩出来浓度比不上NEB的，速度和保真性可以保证和NEB的一样，buffer和NEB的比也有自己的优势，可以做出一些他做不出的；
6 P2 {; o0 K4 w: i2 G5 P9 P; T9 O9 q如果是扩基因组，可以用Takara的酶，我们做很多UTR都是用takara的做出来的，NEB的不太行，具体什么原因我也不清楚。
6 w: \8 P/ T) Q8 }7 _7 k最后说一句，没有最牛的酶，只有最牛的技术员，哈哈！！4 d8 h& A8 J7 O" g0 _; X) w. S9 Y" [
本人PCR牛人，大家交流哈。

shihuijunm

选好的PCR酶，保真性高的,譬如Pfu DNA Polymerase ；能满足长片段目的条带扩增的需要。

shihuijunm

+ w- V* \7 [- K/ [" X
8 @3 Z3 j2 T" n: e: [" \& g选好的PCR酶，保真性高的,

franklinhg

用高保真的PCR聚合酶probest基本可以解决这个问题哈
, j8 A, T% n6 c1 d3 K但是实验的时间和工作量都比较大

hawkyiger

进行长片段PCR扩增时，引物长度一般为24~34个核苷酸，溶点在60~68℃间。使用这类引物可提高PCR反应的退火温度来增加反应的特异性。这点非常重要，长片段扩增的效果往往受到非特异性短片段优先扩增的影响。