如何用PCR扩增长的片段

plando

最近，需要扩增较长的片段，约为7kb，有什么简便易行的好方法？请教！多谢！

ziyunfei1982

选好的PCR用的酶，要求保真性高的，扩增效率好的。分开几段扩增，然后桥接PCR
$ y  M  B# k* Y9 M4 z会很辛苦，看运气了。

hawkyiger

进行长片段PCR扩增时，引物长度一般为24~34个核苷酸，溶点在60~68℃间。使用这类引物可提高PCR反应的退火温度来增加反应的特异性。这点非常重要，长片段扩增的效果往往受到非特异性短片段优先扩增的影响。

franklinhg

用高保真的PCR聚合酶probest基本可以解决这个问题哈
' J( T/ a. b5 `6 x但是实验的时间和工作量都比较大

shihuijunm

. m' ^/ l( \. Z( q: @
9 N1 q% J( Z; y选好的PCR酶，保真性高的,

shihuijunm

选好的PCR酶，保真性高的,譬如Pfu DNA Polymerase ；能满足长片段目的条带扩增的需要。

weiyepan

如果条件比较好的，强烈推荐使用NEB的Phusion酶，1分钟4kb，扩30循环可以50%以上克隆无突变，扩出来片断又浓又干净，本人亲身验证扩增13kb条带，又快又好用；& f: T2 e) N  Z1 D$ X
如果条件不是太好，可以用我们公司的HSHF，就是扩出来浓度比不上NEB的，速度和保真性可以保证和NEB的一样，buffer和NEB的比也有自己的优势，可以做出一些他做不出的；
. e9 A2 P) P1 K" D; T8 ~/ i如果是扩基因组，可以用Takara的酶，我们做很多UTR都是用takara的做出来的，NEB的不太行，具体什么原因我也不清楚。7 _! e1 {9 x, D) k2 B' i
最后说一句，没有最牛的酶，只有最牛的技术员，哈哈！！! l+ I' E2 g; a9 c
本人PCR牛人，大家交流哈。

weiyepan

回复 3# hawkyiger
) J8 f( j* i- ?+ ?4 f) }另外拍一下hawkyiger的砖，PCR的引物不是看长度论退火的：
, g7 m1 N2 T! J! ]; p首先，引物设计推荐使用Primer Premer 5，直接算引物温度，算出来是比较准的，实际做的时候还可以提高1~2度，有时候引物就算20多个碱基，但是Tm才不到60度，是要看GC含量的；' `7 p& t, G* Q. x( U9 p
第二，并不是说TM要在60~68之间的最好，其实如果能拿到短引物，特异性比较高的，就算50多度也是很理想的。有人说长引物特异性高，在我看来这是不对的。长引物更容易引起错配，大家可以自己去想想为什么。错配是可以在Primer Premer 5里面找出来的，如果算出来的自由能>20，那么这个引物已经很难做了，如果自由能>30，我建议重新设引物算了；, i+ c; P' D. {! v
第三，如果你的长片断是在基因组或者是逆转录文库里面，我建议就不用做了，因为能扩出来正确的几率微乎其微，还是去找模板实际。这不是酶和引物可以解决的问题。

yueyongheng

个人认为TOYOBO公司的PCR酶系列很不错，尤其是KOD FX 。! T. V! X" G* j! ?
普通 PCR反应：9 Q) r& ~& `+ [
Taq DNA Polymerase 8 J+ Y1 Z3 N( J4 P0 J4 d
rTth DNA Polymerase
( b$ M* I- }- i) j0 t5 O  ]高效率 PCR反应：
& B; l  w5 K  F; N4 L! _! `Blend Taq 2 M$ H0 w3 |' y/ R  n7 Z; B/ F5 R  d9 L
Blend Taq Taq-Plus Plus-
( M. D2 Q+ I( d" w; P# x# TKOD Dash (LDP LDP-101)
5 {/ m  {0 `1 X  ^KOD KOD-Plus Plus-
) @5 A' k$ `' Z# |KOD KOD-Plus Plus-Ver.2
# ^- z$ d/ J7 M2 gKOD FX
3 q" _% _' F6 k0 V  P1 ?高保真 PCR反应：6 h  U* C9 q6 K" P9 M; D
KOD DNA Polymerase- `. ]- ?5 U. e& @0 I4 b  v0 i
KOD KOD-Plus Plus- 5 r8 L6 @8 W" v% _5 C  n
KOD KOD-Plus Plus-Ver.2
( p2 {: s. h$ O% ~/ t# A# I7 I, aKOD FX ' e' }9 {0 x' P8 p" q2 X: x
长片段 PCR反应：
' F! z& @9 {$ G8 h3 J7 G- j6 mBlend Taq Taq
8 T  E: B, `- o, Z/ u, s. mBlend Taq Taq-Plus Plus-3 t+ F7 }4 z$ _* u: i- u
KOD Dash , n) ?! T; @: Y6 h
KOD FX

exin11

学习了