如何用PCR扩增长的片段

plando

最近，需要扩增较长的片段，约为7kb，有什么简便易行的好方法？请教！多谢！

ziyunfei1982

选好的PCR用的酶，要求保真性高的，扩增效率好的。分开几段扩增，然后桥接PCR
* ~: k  U  F& e( t7 E1 i' M会很辛苦，看运气了。

hawkyiger

进行长片段PCR扩增时，引物长度一般为24~34个核苷酸，溶点在60~68℃间。使用这类引物可提高PCR反应的退火温度来增加反应的特异性。这点非常重要，长片段扩增的效果往往受到非特异性短片段优先扩增的影响。

franklinhg

用高保真的PCR聚合酶probest基本可以解决这个问题哈
2 u' j/ j! B. O. r但是实验的时间和工作量都比较大

shihuijunm

- N1 [7 s) `+ ~0 w# V0 j/ n# Z9 J
6 k' u( N5 J2 d$ x选好的PCR酶，保真性高的,

shihuijunm

选好的PCR酶，保真性高的,譬如Pfu DNA Polymerase ；能满足长片段目的条带扩增的需要。

weiyepan

如果条件比较好的，强烈推荐使用NEB的Phusion酶，1分钟4kb，扩30循环可以50%以上克隆无突变，扩出来片断又浓又干净，本人亲身验证扩增13kb条带，又快又好用；
# Q% Y& n, e; j6 j6 ~如果条件不是太好，可以用我们公司的HSHF，就是扩出来浓度比不上NEB的，速度和保真性可以保证和NEB的一样，buffer和NEB的比也有自己的优势，可以做出一些他做不出的；; f! }5 R1 h4 s  T4 X" L7 R& `& M
如果是扩基因组，可以用Takara的酶，我们做很多UTR都是用takara的做出来的，NEB的不太行，具体什么原因我也不清楚。
9 x& Q- B/ i$ S! U, u) i最后说一句，没有最牛的酶，只有最牛的技术员，哈哈！！8 W) Z6 ]) t8 l( Q
本人PCR牛人，大家交流哈。

weiyepan

回复 3# hawkyiger
. Y* Q1 w0 j! w, U$ b另外拍一下hawkyiger的砖，PCR的引物不是看长度论退火的：/ `' C2 w2 P9 _
首先，引物设计推荐使用Primer Premer 5，直接算引物温度，算出来是比较准的，实际做的时候还可以提高1~2度，有时候引物就算20多个碱基，但是Tm才不到60度，是要看GC含量的；
& u! s* C1 c% Y0 U第二，并不是说TM要在60~68之间的最好，其实如果能拿到短引物，特异性比较高的，就算50多度也是很理想的。有人说长引物特异性高，在我看来这是不对的。长引物更容易引起错配，大家可以自己去想想为什么。错配是可以在Primer Premer 5里面找出来的，如果算出来的自由能>20，那么这个引物已经很难做了，如果自由能>30，我建议重新设引物算了；
/ n4 L, S8 |5 B1 V% }第三，如果你的长片断是在基因组或者是逆转录文库里面，我建议就不用做了，因为能扩出来正确的几率微乎其微，还是去找模板实际。这不是酶和引物可以解决的问题。

yueyongheng

个人认为TOYOBO公司的PCR酶系列很不错，尤其是KOD FX 。
9 ]' [2 [2 y6 I8 d0 d普通 PCR反应：) G+ x6 r) t. h% e" m: I
Taq DNA Polymerase " w2 Q, z9 c7 d* X8 o& R3 n
rTth DNA Polymerase , q+ Q6 z5 ~) x. x
高效率 PCR反应：8 b0 m% C3 ~6 Y+ Q% W5 @8 o
Blend Taq 5 t( Z5 q* T2 L* g7 \" k2 i
Blend Taq Taq-Plus Plus- . ], z" q4 H1 q- G  U9 K6 i
KOD Dash (LDP LDP-101)
: G, _$ e6 F  A( v% H- ~KOD KOD-Plus Plus-
9 F9 g: O# L! {3 n- }KOD KOD-Plus Plus-Ver.2 4 Z+ ?2 O$ _( \
KOD FX
6 |) h$ d4 R2 L1 G: P8 t高保真 PCR反应：) u1 i: k: K2 ]
KOD DNA Polymerase
/ r- r3 q/ k) w( vKOD KOD-Plus Plus-
9 J- |4 F, X, z" b3 _9 v9 g9 KKOD KOD-Plus Plus-Ver.2
: H! F1 H& c9 EKOD FX
  F$ H. o9 c# X" {长片段 PCR反应：' j( ?6 k: b; W; ]) T2 Z% F4 }. S5 N* b
Blend Taq Taq% `: l* w0 {4 W% d* r- ~3 O
Blend Taq Taq-Plus Plus-; x$ d! |3 F% s( L% V3 {
KOD Dash
4 H+ [- Q# e! `# ]KOD FX

exin11

学习了