MSC诱导分化专题

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样本:: j* r4 K$ x. v) V  k  b
MSC向成骨细胞的诱导分化
5 J3 Q$ Y0 _+ H2 m% r  g# R3 t6 G(1)取P2代MSC在传代的同时以2×104/cm2的密度接种于24孔板中，每孔加入15%FBS，1ng/ml bFGF的低糖DMEM培养液0.8ml；
2 }' C& L8 I7 E0 g/ Q9 t(2)待细胞达80%融合，换为诱导培养液(高糖DMEM, 地塞米松 10-8M, β-磷酸甘油1.5mg/ml,抗坏血酸50μg/ml)，以后每3～4d换一次液；9 A  L* H  O: r
(3)2w后进行茜素S染色鉴定。" Y. t$ W) W6 R
3.2.3 MSC向脂肪细胞的诱导分化2 m5 _+ U2 P& K& _6 l! ^$ f
(1)取P2代MSC在传代的同时以2×104/cm2的密度接种于24孔板中，每孔加入15%FBS，1ng/ml bFGF的低糖DMEM培养液0.8ml；+ ?& K' b% ^' ^4 p# ~& i, @6 S
(2)待细胞达80%融合，换为诱导培养液(高糖DMEM, FBS 15%, 胰岛素 10ng/ul)，以后每3～4d换一次液；3 R4 ~- B2 u' l2 S& c4 W
(3)2w后进行苏丹Ⅳ染色鉴定。" [8 U' R* {9 z/ V  C* c  E+ j
MSC的成骨和成脂肪的检测0 N. Z9 }  q& p: b3 Q+ Q
茜素S染色方法
2 J5 E  W/ w! A  ?# |! M: ](1)吸去培养液，PBS洗2次，每次5min;
3 N# A# D) y1 Z9 S9 A(2)90%乙醇固定15min，蒸馏水洗2次；: A" C+ c7 V+ B" @2 q
(3)茜素S染色8min，蒸馏水洗2次,70%、95%及100%的乙醇分别固定5min,甘油封片。
" V8 c+ H' Q  i) M苏丹Ⅳ染色方法
! b6 ~9 c9 `; n  z) z  S1 a(1)吸去培养液后用PBS洗2次，每次5min；
( H. F- D  b$ P1 G' y(2)10%甲醛固定15min，蒸馏水洗2次；
! C6 C- s4 i- V# ~6 c4 Y' J9 H+ D8 X7 t(3)苏丹Ⅳ染色8min，蒸馏水洗2次,苏木精染色10min，自来水洗。甘油封片。

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成软骨细胞的诱导* e* K- Z5 k* u9 r* B5 o6 {
选前 三 代 生长良好的MSCs，消化后制成单细胞悬液，以3X 1 0"/ml的密度接
% t# x' K0 r. J$ ]3 L. c种于 细胞瓶中，待细胞达到80-90%融合后，每隔三天换液一次，倒置显微镜下观察 。14 天后 终止诱导。提取总RNA，设计II型前胶元的引物序列，COL(I I) 上游:5 ' -TTC AGC TAT GGA GAT GAC AAT C-3‘，下游:5’-AGA GTC CTA GAG TGA CTGAG-3 ，产物片断4756p，进行RT-PCR扩增。其产物经琼脂糖凝胶电泳后观察，检测II型前胶元mRNA的表达。! l4 [5 `% ^! ]3 X( b4 N# B
软骨细胞诱导液:" w) o: K& M9 V; v4 r
DEM E 高糖 培养液，10%胎牛血清，100u/ml青霉素，l00g/ml链霉素，TGF0 g5 s8 X+ \- k1 _& ~
-P }10ng/ml，抗坏血酸50ug/mla

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体外诱导MSCs向神经细胞分化' K& Z& R1 a: l0 j0 A; {
体外诱导MSCs向神经细胞分化+ z. y, W) w" |# j; {
取体 外扩增至第2代的MScs，以lx105/ml浓度接种于放置有消毒盖玻片
& T8 T6 x5 T! T  q; J的6孔板内，制备细胞爬片。lw后进行诱导:加10ng/1lllEGF+含10%FBs
  \3 }% Z, O/ F2 a的培养液预诱导3d，加lm oFLBME+含10%FBS的培养液预诱导ld，24h& D2 |2 q7 `/ P0 O. y7 z
后加1林mo比声JRA+含10%FBs的培养液进行诱导。诱导24h后密切观察，可见多数细胞形成明显的神经元样细胞形态，胞体呈圆形，突起较长，双极或多极形，在突起末端出现分支，部分相邻细胞的突起连接成网。

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选择合适的代数（P3-5代）进行多向诱导分化# j! I" O+ F5 C8 t/ s5 D3 a4 g
成骨诱导培养液的配置：含10%FBS的α-MEM培养液中添加50 μM 抗坏血酸, 10mmβ-磷酸甘油 和 100nm 地塞米松；取P4细胞，按照5×103个/cm2接种6孔板，在生长培养液（α-MEM培养液）中长到基本融合时，更换成成骨诱导培养液，每3d换液，于 7d时进行碱性磷酸酶染色，28d时进行矿化结节的茜素红染色。
* [" ?; B5 X' q% G1 ?+ o) G茜素红染色：吸去培养液，PBS冲洗两遍；10%甲醛实温固定15min； ddH2O冲洗两遍； 加入1ml/孔的40mM的茜素红染色液，室温孵育 20min并轻微振荡；吸取未结合的燃料，用ddH2O漂洗并振荡5min重复4次；倾斜放置2min,吸取多余的ddH2O；倒置显微镜观察拍照记录。
' v. M. w9 P$ K) c% ?- w+ R7 |1 |/ Z
* _. B' ^0 e# m* G4 W# a/ F1 y- S成脂诱导培养液的配置：含10%FBS的HG-DMEM培养液中添加1μM地塞米松,10μg/ml胰岛素，200μM吲哚美辛和0.5mM IBMX；取P4细胞，按照2×104个/cm2接种6孔板，在生长培养液（HG-DMEM培养液）中长到基本融合时，更换成脂诱导培养液诱导2d,再用只含有10μg/ml胰岛素的成脂维持液培养1d，如此循环培养至14天，进行油红O染色。
% L9 L3 Z) w4 n+ i2 t. T油红O染色：吸去培养液，PBS冲洗两遍；27.5%甲醛室温固定20min；ddH2O冲洗三遍，空气干燥；加入0.5%的油红O,室温孵育1h；70%乙醇洗涤3次；倒置显微镜观察拍照记录。

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肝样细胞诱导分化[1~3]2 h6 i7 t2 u5 j
DMEM中补充bFGF\HGF分别至20ng/ml和10ng/ml，3天换液一次，重新补充因子，在7天左右可以检测得到肝特异基因，蛋白AFP，ALB等的表达
/ W3 {) ^  [( D7 W
8 k3 \7 z  I/ q1.Shin-Yeu Onga, Hui Daia, Kam W. Leonga,b, Inducing hepatic differentiation of human mesenchymal stem cells in pellet culture. Biomaterials. 2006, 4087–4097) P$ k( ?2 M" c  s
2. Taléns-Visconti a, A. Bonora a, R. Jover a, V. Mirabet b, F. Carbonell b.
, D' C" l0 h. a" v  r. DHuman mesenchymal stem cells from adipose tissue: DiVerentiation
, K+ l' ~- N4 }4 {( rinto hepatic lineage .oxicology in Vitro 21 (2007) 324–329
5 Q$ u# m5 R7 ~# f0 O6 k& {3.Qing-Jun Zhoua, Yan-Dan Huanga,1, Li-Xin Xiang. In vitro differentiation of embryonic stem cells into hepatocytes induced by fibroblast growth factors. the International Journal of Biochemistry & Cell Biology ,2007,1714–1721

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2.rMSCs成骨和脂肪细胞诱导分化0 \0 H) l; p5 X. |& r$ \0 g* M
2.1体外定向诱导rMSCs分化为成骨细胞5 a9 n$ k9 C0 R9 T1 _
以接种密度为4×103/cm2将P3代rMSCs接种于预先置有盖玻片的6孔板内以制备细胞爬片。待细胞融合达80%,吸去孔内培养液,实验组每孔加入成骨条件培养基2mL置培养箱中,隔天换液1次，共诱导3周。对照组加入含10%胎牛血清(FCS)的L-DMEM培养液。3周末应用茜素红S染色法检测钙沉积。
. O! I! N4 {, q6 g  K茜素红S染色法步骤：1 E. @) Y5 \5 |$ v4 E
(1)诱导第21天,吸去成骨条件培养基,PBS洗涤3次0 k* s  ^% T, |2 K0 d
(2)茜素红染2min。
5 q7 W3 r* o) B- ~* i& y* R8 M(3)蒸馏水洗5-10s。
/ e5 S/ z4 {( `% b" C(4)分化液洗15s。. p# }" x( r( W7 b, I$ Q
(5)PBS洗涤3次，显微镜下观察并拍照。' B/ B, L% R1 a7 |
2.2体外定向诱导rMSCs分化为脂肪细胞- X3 B' |' n2 L( Z' m2 i
以4 ×103/cm2将P3代rMSCs密度接种于预先置有盖玻片的6孔板内以制备细胞爬片。细胞达到80％融合后,加入成脂条件培养基2 mL置培养箱中,隔天换液1次，共诱导3周。对照组加入含10%胎牛血清(FCS)的L-DMEM培养液。3周末应用油红O染色法检测脂滴形成) l/ C; X) \9 @- \! c
油红O染色法步骤：& C1 s: C! `) }( Z) e$ P
(1)细胞爬片用PBS清洗两次，每次5min;
4 }* D: c6 a, y4 X4 O. ~(2)4%多聚甲醛固定15 min;' G- b" _! V7 f
(3)PBS漂洗两次，每次5min;
* D1 T7 x! ^; I# ?(4)入60%异丙醇漂洗。+ C: W6 u. Y( ^6 A  G. [- P2 X
(5)入油红O染色15分钟。8 L( v7 H5 R1 |! @9 q! O
Devil60%异丙醇漂洗。
3 z0 W! v# I( W& ~, u- H2 x" R: I  ?9 |
3.rMSCs成肌细胞诱导分化
2 o9 j' o5 a8 P7 b0 f5 b以4 ×103/cm2将P3代rMSCs密度接种于预先置有盖玻片的6孔板内以制备细胞爬片。细胞达到80％融合后,加入含五氮杂胞苷（10umol/L，用 PBS配制）的DMEM2 mL置培养箱培养24小时,然后换用含有2%马血清的DMEM培养基培养7——10天。对照组换用PBS诱导24小时后，加入含2%马血清的L-DMEM 培养液。鉴定：可用MHC,MYOD,MYOGENIN,MHC等肌性标记物行免疫荧光染色。
; u: f- X4 K  }$ X/ b4 M4 i8 N3 n参考文献：1.Wakitani, S., T. Saito, and A.I. Caplan, Myogenic cells derived from rat bone marrow mesenchymal stem cells exposed to 5-azacytidine. Muscle Nerve, 1995. 18(12): p. 1417-26.

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新西兰大白兔的肌源性干细胞MDSC诱导分化平滑肌细胞SMC
8 |; M# }8 r9 M; F+ a一、利用差速贴壁法分离兔MDSC及鉴定：- k9 ~4 n' R4 M- o4 d
1、根据Qu～1方法改进：麻醉1.5个月龄2.0kg新西兰兔，无菌切取10g大腿肌肉，剪成肉泥并置入15ml无菌离心管中。
1 E, u. ]6 _0 C( r2、分别用0.2％的ⅩⅠ型胶原酶消化1h、dispase消化45min以及0.1%trypsin消化30min。. O( j, y1 ?% I( W4 t2 S) x" E
3、消化均在37℃恒温培养箱内进行，每次消化指间需离心并取沉淀进行下一步消化。6 r- i& m1 v* W9 j% h* P# y* y2 Q
4、消化后的沉淀用增殖培养基重悬，并接种在用胶原（0.1％鼠尾胶溶液，自制）包被的培养瓶中，该瓶称为PP1。
' D" ^) u# ?7 ?8 M( ?  r5、PP1于37℃、5％CO2的细胞培养箱中静置过夜，随后将悬液转移到另一个胶原包被的培养瓶中培养，称为PP2。
3 C7 j6 @# a) v. {" I8 \9 ^6、此后连续4d每隔24h将悬液离心、重悬后转移至新的培养瓶中，分别为PP3-PP6。
- x8 j3 K: t# p, l+ R+ ~. o7、PP1-PP5弃去不用，PP6用于进一步诱导分化实验，细胞在达到约30％汇合时必须传代，继续接种至胶原预包被的新培养瓶内加入增殖培养基进行培养。* F9 e, w  s, G/ m
8、PP6在汇合度达到30%前进行细胞表型鉴定，分别采用FCM检测desmin、CD45、bcl-2的阳性细胞数百分率。
3 g5 w2 k7 K+ T- O; I# K" F" c9、采用免疫细胞化学检测desmin的表达情况。. G  w/ i3 g9 K+ d4 Y+ L* ^- p
二、诱导分化实验：! K: l+ `! e6 D2 r
取PP6进行诱导，采用两种方法：
9 R& l2 ^  O4 I7 P4 L+ ^* X, a6 b4 a0 s; \2 S0 S' _" {
1、共培养诱导：
/ W  l  P1 Z4 J7 x' m细胞消化后离心去上清，用浓度为5mg/L的Hoechst33342（用增殖培养基配制）重悬，避光并在细胞培养箱内孵育20min，随后离心去上清，用增殖培养基重悬，调整密度至1x10~3个/ml，接种到6孔板，每个孔内加入等量的兔阴茎海绵体平滑肌细胞CCSMC进行共培养，2d后进行免疫组化检测α－SMA表达情况。. r7 Y3 o9 C  x/ s  X1 J
另设一组对称的未处理组，即PP6单独培养组，以及CCSMC组作为阳性对照，进行激光共聚焦显微镜观察及拍照。$ ?" H. z. c$ S, ?
2、直接诱导：& e+ ]# d! g$ w4 o$ X5 F
细胞消化下来后接种到6孔板，并且添加VEGF，使其在每孔的终浓度为25ug/L，置入培养箱，2d后进行免疫细胞化学以及Western blot法检测α－SMA表达情况（选用GAPDH作为内参）。: U7 R' D& G1 C" x6 p& h
同时另设一对称的未处理组，即未添加VEGF的PP6单独培养，并设立成纤维细胞组作为阴性对照，以及CCSMC组作为阳性对照。
7 `. i3 i8 e3 c7 [+ E# H) S. Z3 ~" A7 \
增殖培养基：20％的胎牛血清、20％马血清、80％DMED-LG
7 N! K: r: `% j- i$ F: R* q* J
8 l% a5 D) T, `
$ i' M3 l  P) nQu Z,Balkir L,Van Deutekom JC,et al. Development of approaches to improve cell survival in myoblast transfer therapy.J Cell Biol.1998,142:1257-1267

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CD34+CD38-的干细胞向 粒系的诱导分化:
( J* s! U$ H& c/ I) P细胞培养体系为lml,200微升的胎牛血清,800微升的IMEM,SCF 10ng, IL-3 5ng,
- e* N8 L2 e0 D6 C& n+ u, PGM-CSF 5ng, G-CSF 5000U,前面三个因子是peprotech公司的,后一细胞因子就是临床的瑞白.在诱导的第七天可见所有的细胞都表达CD33,在诱导的14天可见90%的细胞CD15明显表达!

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脐血造血干细胞诱导分化为巨核细胞
( \2 `  Q- l  p# _% `2 rx123u：脐血造血干细胞诱导分化为巨核细胞1 P* \# m9 j% W  u' r% l

9 d; y0 p3 c  Y. N+ V6 B% U, t0 a1．用含肝素抗凝的无菌干燥瓶收集，采血量为80-100 ml。
! I' \" _4 N) {& N6 g
& ?2 `1 C4 D2 Y0 p1 d. x2．细胞因子：TPO、FLT3-L 、IL-3、IL-6和SCF。
1 v$ {2 k8 {) v+ u/ p5 ?. s% [/ a4 S; O% M  H
3．应用免疫磁珠MACS方法分离脐血CD34＋细胞，然后取部分细胞进行流式细胞仪测定、鉴定和分离纯度。
5 F* K+ e, o5 |5 Z% z( Q, }" ~6 m" G: ~
4．诱导方案：CD41＋细胞的体外诱导扩增用含10％ FCS和5×10 mol/L二巯基乙醇的IMDM，将CD34＋细胞浓度调整为2×10/ml，加入24孔板，每孔终体积为1mL。细胞因子组合为：TPO+SCF+ IL3+IL6，细胞因子的终浓度为：IL3 10 ng/ml，IL-6 10 ng/ml，SCF 50 ng/ml，TPO 10 ng/ml，FLT-3L 10 ng/ml。将上述扩增体系置37度饱和湿度CO2培养箱中培养，每3天半量换液1次，添加全量的造血生长因子，培养3周，在培养的第7天或14天测定培养体系的总细胞数，用流式细胞仪测定 CD41＋细胞的含量即为巨核细胞。* n% [( P* X3 N

3 N6 u4 V5 Y: _0 [6 ~5．甲基纤维素半固体培养法培养对CD41＋细胞进行集落培养以进一步鉴定。
5 f4 L9 Y/ m4 l/ g
* `  P% {9 s) a) Q7 l5 \; X+ S, G参考文献：
* z, G/ i9 Z8 R/ O6 J1.Williams JL．Pipia GG ，Datta NS，et al. Thrombopoietin rquires additional mgakaryocyte-active cytokines for optimal，ex vivo expansion of megakaryocyte precursor cyells．Blood，1998；91：4118-4l26.
0 f. f! u6 m  ~+ z: M9 L) M2.Li K．Yan g M，Lam AC，et al. Efects offit3 ligan d in combination with TPO on the expan sion of megakaryocytic progenitors．Cell Transplant，2000；9：125-131.

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zeronepl# H; u& }# l& m3 j2 R
1.1 BMSCs向成骨细胞诱导分化  B$ s+ w6 [2 \% K5 }1 v. Y
诱导剂主要有10-8mol/L地塞米松、50μg/ml抗坏血酸、10mmol/L β-甘油磷酸钠、FBS和DMEM-LG液。) i- S3 O1 f7 k  k: X! B( M: l/ L% t; f
1.2 BMSCs向软骨细胞诱导分化
" f& u5 C3 M, t9 G- H; E# P3 S诱导剂主要有胰岛素、转铁蛋白、牛血清白蛋白、丙酮酸钠、亚油酸、维生素C、地塞米松、TGF-β。0 f! y0 N& N3 m2 L
1.3 BMSCs向脂肪细胞诱导分化5 b1 ^5 p. M6 P8 U$ X1 V
诱导剂主要有1-甲基-3-异丁基黄嘌呤、胰岛素、地塞米松和消炎痛等。9 f  u, k, @& i, d& Y; Q
1.4 BMSCs向神经细胞诱导分化
/ t& b" q% d9 ^- }- [& A5 K+ r/ a诱导剂主要有β-巯基乙醇、二甲基亚砜、丁化羟基苯甲醚。6 y2 w- _6 w6 y. Z. G
1.5 BMSCs向内皮细胞诱导分化
. V4 B" ~6 E) F, I" S* U3 F8 G0 R诱导剂主要有胰岛素、转铁蛋白、硒、牛血清白蛋白、地塞米松、2-磷酸抗坏血酸及微量VEGF等。
0 s3 V, Y' D- w# }2 F1.6 BMSCs向肝细胞诱导分化
! O! Z! ~4 P/ e9 P1 m1.7 BMSCs向心肌细胞诱导分化: X: @& N  V. a; U/ D! c
诱导剂主要有5-氮胞苷。
3 x4 a3 {7 ~$ G1.8 BMSCs向胰岛细胞诱导分化/ O/ h- u& [$ t+ y" m' G
诱导剂主要有β-巯基乙醇、尼克酰胺、B27。