MSC诱导分化专题

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样本:6 g! c0 Y/ H4 A' Z/ ]' S% C
MSC向成骨细胞的诱导分化
9 K0 _, O/ `) J6 C3 [(1)取P2代MSC在传代的同时以2×104/cm2的密度接种于24孔板中，每孔加入15%FBS，1ng/ml bFGF的低糖DMEM培养液0.8ml；; z" i9 w! d# u$ R2 Y
(2)待细胞达80%融合，换为诱导培养液(高糖DMEM, 地塞米松 10-8M, β-磷酸甘油1.5mg/ml,抗坏血酸50μg/ml)，以后每3～4d换一次液；
8 {6 b4 G! y: k, z7 K( v* ~$ {$ e" p* `(3)2w后进行茜素S染色鉴定。4 Y$ }; ?/ j3 f
3.2.3 MSC向脂肪细胞的诱导分化
( X% `; L- Y7 E! H6 l(1)取P2代MSC在传代的同时以2×104/cm2的密度接种于24孔板中，每孔加入15%FBS，1ng/ml bFGF的低糖DMEM培养液0.8ml；4 {8 N3 q! o8 R8 Y$ ~, Q3 B
(2)待细胞达80%融合，换为诱导培养液(高糖DMEM, FBS 15%, 胰岛素 10ng/ul)，以后每3～4d换一次液；5 g9 T  Z& s, f7 X3 C* O- \
(3)2w后进行苏丹Ⅳ染色鉴定。3 k& Z( A2 Z- C
MSC的成骨和成脂肪的检测# E5 {7 M$ _* z/ o2 S
茜素S染色方法
' m1 B+ F0 c# S9 `(1)吸去培养液，PBS洗2次，每次5min;: r9 X8 S( S- V, `+ o
(2)90%乙醇固定15min，蒸馏水洗2次；
1 N3 F: E1 F# {3 i8 T(3)茜素S染色8min，蒸馏水洗2次,70%、95%及100%的乙醇分别固定5min,甘油封片。
. B: i  X" X  i. ^# H  h苏丹Ⅳ染色方法1 H5 m) E, g: S+ W  A
(1)吸去培养液后用PBS洗2次，每次5min；
% n/ Y( s1 G7 g. X$ {1 O(2)10%甲醛固定15min，蒸馏水洗2次；' X& S: Y3 I. J+ i& n$ J
(3)苏丹Ⅳ染色8min，蒸馏水洗2次,苏木精染色10min，自来水洗。甘油封片。

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成软骨细胞的诱导
7 V8 u  K0 P  a9 j* U, c! I; g选前 三 代 生长良好的MSCs，消化后制成单细胞悬液，以3X 1 0"/ml的密度接  q" z9 E9 a- F3 w7 j, v# {* C
种于 细胞瓶中，待细胞达到80-90%融合后，每隔三天换液一次，倒置显微镜下观察 。14 天后 终止诱导。提取总RNA，设计II型前胶元的引物序列，COL(I I) 上游:5 ' -TTC AGC TAT GGA GAT GAC AAT C-3‘，下游:5’-AGA GTC CTA GAG TGA CTGAG-3 ，产物片断4756p，进行RT-PCR扩增。其产物经琼脂糖凝胶电泳后观察，检测II型前胶元mRNA的表达。' \% u2 @8 D% l0 m' I
软骨细胞诱导液:
( L+ ?6 O% z  a; PDEM E 高糖 培养液，10%胎牛血清，100u/ml青霉素，l00g/ml链霉素，TGF
/ E$ \! I$ N( |. P3 Q-P }10ng/ml，抗坏血酸50ug/mla

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体外诱导MSCs向神经细胞分化* O( k8 Q0 ^% ~& Y2 [' m. \1 G7 M8 F
体外诱导MSCs向神经细胞分化9 W" Y: W/ o% }! i4 Z8 ?
取体 外扩增至第2代的MScs，以lx105/ml浓度接种于放置有消毒盖玻片* [8 ?/ z$ C7 ^, c
的6孔板内，制备细胞爬片。lw后进行诱导:加10ng/1lllEGF+含10%FBs3 T. p4 ]' X9 f+ l& U- B$ f
的培养液预诱导3d，加lm oFLBME+含10%FBS的培养液预诱导ld，24h
3 a$ a, H# \3 B; I后加1林mo比声JRA+含10%FBs的培养液进行诱导。诱导24h后密切观察，可见多数细胞形成明显的神经元样细胞形态，胞体呈圆形，突起较长，双极或多极形，在突起末端出现分支，部分相邻细胞的突起连接成网。

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选择合适的代数（P3-5代）进行多向诱导分化6 @/ J- k" @& Y: w0 `4 Q+ K" e
成骨诱导培养液的配置：含10%FBS的α-MEM培养液中添加50 μM 抗坏血酸, 10mmβ-磷酸甘油 和 100nm 地塞米松；取P4细胞，按照5×103个/cm2接种6孔板，在生长培养液（α-MEM培养液）中长到基本融合时，更换成成骨诱导培养液，每3d换液，于 7d时进行碱性磷酸酶染色，28d时进行矿化结节的茜素红染色。, r  v9 b8 y1 \1 b
茜素红染色：吸去培养液，PBS冲洗两遍；10%甲醛实温固定15min； ddH2O冲洗两遍； 加入1ml/孔的40mM的茜素红染色液，室温孵育 20min并轻微振荡；吸取未结合的燃料，用ddH2O漂洗并振荡5min重复4次；倾斜放置2min,吸取多余的ddH2O；倒置显微镜观察拍照记录。# @& Q/ |  d$ ~# c2 I! ?

7 A% ]3 s! A2 \. _9 N/ g成脂诱导培养液的配置：含10%FBS的HG-DMEM培养液中添加1μM地塞米松,10μg/ml胰岛素，200μM吲哚美辛和0.5mM IBMX；取P4细胞，按照2×104个/cm2接种6孔板，在生长培养液（HG-DMEM培养液）中长到基本融合时，更换成脂诱导培养液诱导2d,再用只含有10μg/ml胰岛素的成脂维持液培养1d，如此循环培养至14天，进行油红O染色。
: J: A' \6 H" h" `7 }2 p油红O染色：吸去培养液，PBS冲洗两遍；27.5%甲醛室温固定20min；ddH2O冲洗三遍，空气干燥；加入0.5%的油红O,室温孵育1h；70%乙醇洗涤3次；倒置显微镜观察拍照记录。

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肝样细胞诱导分化[1~3]
2 C) a# }9 u5 b1 s8 cDMEM中补充bFGF\HGF分别至20ng/ml和10ng/ml，3天换液一次，重新补充因子，在7天左右可以检测得到肝特异基因，蛋白AFP，ALB等的表达6 K- L/ b0 a& T. F9 g$ B
" _5 ^) s8 H- m$ }* W, S) u
1.Shin-Yeu Onga, Hui Daia, Kam W. Leonga,b, Inducing hepatic differentiation of human mesenchymal stem cells in pellet culture. Biomaterials. 2006, 4087–4097
6 J9 U7 Q0 |0 F7 v9 C- Y2. Taléns-Visconti a, A. Bonora a, R. Jover a, V. Mirabet b, F. Carbonell b.' ?6 d* Z0 n% {/ W0 c* e
Human mesenchymal stem cells from adipose tissue: DiVerentiation- t! ^4 [5 r) `% V  I
into hepatic lineage .oxicology in Vitro 21 (2007) 324–329
$ Z  Z, z, E  G$ p# v' w3.Qing-Jun Zhoua, Yan-Dan Huanga,1, Li-Xin Xiang. In vitro differentiation of embryonic stem cells into hepatocytes induced by fibroblast growth factors. the International Journal of Biochemistry & Cell Biology ,2007,1714–1721

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2.rMSCs成骨和脂肪细胞诱导分化
5 o9 }# V( v8 h( r" I2.1体外定向诱导rMSCs分化为成骨细胞' |8 T* \# |0 U
以接种密度为4×103/cm2将P3代rMSCs接种于预先置有盖玻片的6孔板内以制备细胞爬片。待细胞融合达80%,吸去孔内培养液,实验组每孔加入成骨条件培养基2mL置培养箱中,隔天换液1次，共诱导3周。对照组加入含10%胎牛血清(FCS)的L-DMEM培养液。3周末应用茜素红S染色法检测钙沉积。
8 Q3 T' x* ~' `" z% u茜素红S染色法步骤：  ?* u6 Q" ~) P" L8 ?( D( F$ p
(1)诱导第21天,吸去成骨条件培养基,PBS洗涤3次
5 s$ r1 j. F$ F! w7 z5 P$ }& ]; o; a(2)茜素红染2min。* M+ b" j0 F$ z7 M+ G, _7 d3 \
(3)蒸馏水洗5-10s。+ D# }- U1 y8 S/ O0 ?% P9 @' }+ {+ n
(4)分化液洗15s。/ Q4 q: w! u* n- |; Q* O# X
(5)PBS洗涤3次，显微镜下观察并拍照。' S. ^# o1 e: t1 c& [$ G! {! y3 W- Z
2.2体外定向诱导rMSCs分化为脂肪细胞7 V* o. w& a1 L: g* ?2 }3 q
以4 ×103/cm2将P3代rMSCs密度接种于预先置有盖玻片的6孔板内以制备细胞爬片。细胞达到80％融合后,加入成脂条件培养基2 mL置培养箱中,隔天换液1次，共诱导3周。对照组加入含10%胎牛血清(FCS)的L-DMEM培养液。3周末应用油红O染色法检测脂滴形成
. Y2 C. f' [' D8 ]: D油红O染色法步骤：$ R8 y) ]) i' a0 [: m" F
(1)细胞爬片用PBS清洗两次，每次5min;* N. R1 o3 t% Z4 L
(2)4%多聚甲醛固定15 min;, T, b& Q8 Z  g
(3)PBS漂洗两次，每次5min;
: ~4 q* I% s" ]& @$ @" z/ ^% U& p6 n(4)入60%异丙醇漂洗。& q; P8 o1 A! a$ ]4 |
(5)入油红O染色15分钟。
* m5 c: O  u$ p$ P7 xDevil60%异丙醇漂洗。
5 m" y9 v7 {9 m1 @
& u- R5 i3 C4 t8 u0 {5 a! p3 T6 I3.rMSCs成肌细胞诱导分化
, e  X$ \9 u8 }# C% |5 X# Q以4 ×103/cm2将P3代rMSCs密度接种于预先置有盖玻片的6孔板内以制备细胞爬片。细胞达到80％融合后,加入含五氮杂胞苷（10umol/L，用 PBS配制）的DMEM2 mL置培养箱培养24小时,然后换用含有2%马血清的DMEM培养基培养7——10天。对照组换用PBS诱导24小时后，加入含2%马血清的L-DMEM 培养液。鉴定：可用MHC,MYOD,MYOGENIN,MHC等肌性标记物行免疫荧光染色。; o; ?; u9 e0 ^0 _
参考文献：1.Wakitani, S., T. Saito, and A.I. Caplan, Myogenic cells derived from rat bone marrow mesenchymal stem cells exposed to 5-azacytidine. Muscle Nerve, 1995. 18(12): p. 1417-26.

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新西兰大白兔的肌源性干细胞MDSC诱导分化平滑肌细胞SMC+ L) P" V- D) W% E- u  ~0 k7 X8 e) g
一、利用差速贴壁法分离兔MDSC及鉴定：
2 O2 }  N7 p  o8 X3 {: ~1、根据Qu～1方法改进：麻醉1.5个月龄2.0kg新西兰兔，无菌切取10g大腿肌肉，剪成肉泥并置入15ml无菌离心管中。
! Y& ]) Y  {$ [- R& k% u2、分别用0.2％的ⅩⅠ型胶原酶消化1h、dispase消化45min以及0.1%trypsin消化30min。1 x. [* n# _. C$ Y. h* w% j. B+ ]. X
3、消化均在37℃恒温培养箱内进行，每次消化指间需离心并取沉淀进行下一步消化。8 \- ~$ R$ @6 J# p0 B8 O
4、消化后的沉淀用增殖培养基重悬，并接种在用胶原（0.1％鼠尾胶溶液，自制）包被的培养瓶中，该瓶称为PP1。
4 N# E# V  s# ~( ?& y5、PP1于37℃、5％CO2的细胞培养箱中静置过夜，随后将悬液转移到另一个胶原包被的培养瓶中培养，称为PP2。
7 `# o  @- e2 K% |, D+ y& E6、此后连续4d每隔24h将悬液离心、重悬后转移至新的培养瓶中，分别为PP3-PP6。
; s1 g, u: J4 R7 M5 r7、PP1-PP5弃去不用，PP6用于进一步诱导分化实验，细胞在达到约30％汇合时必须传代，继续接种至胶原预包被的新培养瓶内加入增殖培养基进行培养。
* J: z( j" p* b; f" g' q$ E, C8、PP6在汇合度达到30%前进行细胞表型鉴定，分别采用FCM检测desmin、CD45、bcl-2的阳性细胞数百分率。- J( w  K8 K" J% G  ~0 x: }
9、采用免疫细胞化学检测desmin的表达情况。! R( Q$ u+ Y! E, r( \; W' V
二、诱导分化实验：' Q+ D& {; }$ G% [$ B* y
取PP6进行诱导，采用两种方法：1 [9 u. u  v) y; M, {, p6 t
( M) Q% L# n; e  ]; }" X0 O( ?
1、共培养诱导：
+ N5 M3 T6 W1 b细胞消化后离心去上清，用浓度为5mg/L的Hoechst33342（用增殖培养基配制）重悬，避光并在细胞培养箱内孵育20min，随后离心去上清，用增殖培养基重悬，调整密度至1x10~3个/ml，接种到6孔板，每个孔内加入等量的兔阴茎海绵体平滑肌细胞CCSMC进行共培养，2d后进行免疫组化检测α－SMA表达情况。" d4 @0 I& O" u* J
另设一组对称的未处理组，即PP6单独培养组，以及CCSMC组作为阳性对照，进行激光共聚焦显微镜观察及拍照。
6 A+ |" A# K' d- @" Z8 p' n0 D2、直接诱导：
3 A- U! ~# w0 c5 |0 q4 c0 v细胞消化下来后接种到6孔板，并且添加VEGF，使其在每孔的终浓度为25ug/L，置入培养箱，2d后进行免疫细胞化学以及Western blot法检测α－SMA表达情况（选用GAPDH作为内参）。
5 |8 O( a7 Y( d/ D. v% h$ V0 o同时另设一对称的未处理组，即未添加VEGF的PP6单独培养，并设立成纤维细胞组作为阴性对照，以及CCSMC组作为阳性对照。6 s# N4 f4 f/ Y6 s7 p' [7 X
8 m6 L7 b+ ^. Z6 v! S$ H
增殖培养基：20％的胎牛血清、20％马血清、80％DMED-LG6 E1 z" [5 |0 v# [8 A* ]+ y4 `

7 z! g& _1 ~7 i$ I" V8 W8 [8 c& F: T7 f; B, e' i
Qu Z,Balkir L,Van Deutekom JC,et al. Development of approaches to improve cell survival in myoblast transfer therapy.J Cell Biol.1998,142:1257-1267

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CD34+CD38-的干细胞向 粒系的诱导分化:3 [7 K' s$ {. n2 e+ g
细胞培养体系为lml,200微升的胎牛血清,800微升的IMEM,SCF 10ng, IL-3 5ng,
+ T0 D* b5 M5 h( h+ \' ]GM-CSF 5ng, G-CSF 5000U,前面三个因子是peprotech公司的,后一细胞因子就是临床的瑞白.在诱导的第七天可见所有的细胞都表达CD33,在诱导的14天可见90%的细胞CD15明显表达!

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脐血造血干细胞诱导分化为巨核细胞# Q0 K2 f2 a+ }% P
x123u：脐血造血干细胞诱导分化为巨核细胞
* k0 J" P+ c- }& C" x3 a  |5 v; [
1．用含肝素抗凝的无菌干燥瓶收集，采血量为80-100 ml。4 t7 n1 f- C  {/ m
# z& Q& v0 y5 P7 m7 S
2．细胞因子：TPO、FLT3-L 、IL-3、IL-6和SCF。; Y4 }" N5 F; Z5 ]+ m
5 a7 z- ~, v- v' |. j" W
3．应用免疫磁珠MACS方法分离脐血CD34＋细胞，然后取部分细胞进行流式细胞仪测定、鉴定和分离纯度。
5 F; S8 }% S1 i6 e" j) B6 \9 @/ V0 d8 q% L  F, y; K- N
4．诱导方案：CD41＋细胞的体外诱导扩增用含10％ FCS和5×10 mol/L二巯基乙醇的IMDM，将CD34＋细胞浓度调整为2×10/ml，加入24孔板，每孔终体积为1mL。细胞因子组合为：TPO+SCF+ IL3+IL6，细胞因子的终浓度为：IL3 10 ng/ml，IL-6 10 ng/ml，SCF 50 ng/ml，TPO 10 ng/ml，FLT-3L 10 ng/ml。将上述扩增体系置37度饱和湿度CO2培养箱中培养，每3天半量换液1次，添加全量的造血生长因子，培养3周，在培养的第7天或14天测定培养体系的总细胞数，用流式细胞仪测定 CD41＋细胞的含量即为巨核细胞。6 H4 Q  Q5 O$ c
* A+ _( ]6 W0 T
5．甲基纤维素半固体培养法培养对CD41＋细胞进行集落培养以进一步鉴定。
* N* h1 H7 R% {$ ~! g9 w) }$ s
6 L% o8 N0 W0 M4 K3 f1 a参考文献：
7 Z5 i  P# ?( D5 g4 J" O. ]1.Williams JL．Pipia GG ，Datta NS，et al. Thrombopoietin rquires additional mgakaryocyte-active cytokines for optimal，ex vivo expansion of megakaryocyte precursor cyells．Blood，1998；91：4118-4l26.) v9 `! t/ M! A( q
2.Li K．Yan g M，Lam AC，et al. Efects offit3 ligan d in combination with TPO on the expan sion of megakaryocytic progenitors．Cell Transplant，2000；9：125-131.

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zeronepl- J/ ^9 G8 m  j+ }9 D  q2 p: J
1.1 BMSCs向成骨细胞诱导分化
! a2 l7 s/ l6 b( G. s诱导剂主要有10-8mol/L地塞米松、50μg/ml抗坏血酸、10mmol/L β-甘油磷酸钠、FBS和DMEM-LG液。6 S1 |$ s- O( `7 `# l% g" i% R  f
1.2 BMSCs向软骨细胞诱导分化7 L' h/ Q5 w/ ~3 N* M! H. Y
诱导剂主要有胰岛素、转铁蛋白、牛血清白蛋白、丙酮酸钠、亚油酸、维生素C、地塞米松、TGF-β。
$ l1 T8 E! E# {1.3 BMSCs向脂肪细胞诱导分化" Y4 q, J5 d+ @! k
诱导剂主要有1-甲基-3-异丁基黄嘌呤、胰岛素、地塞米松和消炎痛等。
6 f& d, \5 F1 }1.4 BMSCs向神经细胞诱导分化% E, y; X$ y) X6 x
诱导剂主要有β-巯基乙醇、二甲基亚砜、丁化羟基苯甲醚。$ W& ~9 R. K$ c; J$ m( m4 `
1.5 BMSCs向内皮细胞诱导分化
" }6 V! U) B, h: H2 ~5 |诱导剂主要有胰岛素、转铁蛋白、硒、牛血清白蛋白、地塞米松、2-磷酸抗坏血酸及微量VEGF等。8 e7 }2 [6 B+ _4 R+ a
1.6 BMSCs向肝细胞诱导分化& T6 ?, }0 h" C: q9 B0 l! J, h, o+ {
1.7 BMSCs向心肌细胞诱导分化$ D5 j& H: X: O! I4 e. J+ i1 j
诱导剂主要有5-氮胞苷。
  `4 {/ Z) S3 b; @; x1.8 BMSCs向胰岛细胞诱导分化) S4 \7 w/ @6 P) J
诱导剂主要有β-巯基乙醇、尼克酰胺、B27。