MSC诱导分化专题

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样本:
: t8 N0 \7 i' d1 @MSC向成骨细胞的诱导分化
# }" b. |1 _1 G  ^% b3 t  g(1)取P2代MSC在传代的同时以2×104/cm2的密度接种于24孔板中，每孔加入15%FBS，1ng/ml bFGF的低糖DMEM培养液0.8ml；5 e- E9 t: `8 p
(2)待细胞达80%融合，换为诱导培养液(高糖DMEM, 地塞米松 10-8M, β-磷酸甘油1.5mg/ml,抗坏血酸50μg/ml)，以后每3～4d换一次液；  [8 `% H; T/ T$ z6 D$ V7 e+ h
(3)2w后进行茜素S染色鉴定。2 `: @3 \( C& t3 C7 Z3 B) ]0 S
3.2.3 MSC向脂肪细胞的诱导分化, j8 I5 u  T& v9 T+ r' A. q7 H0 g
(1)取P2代MSC在传代的同时以2×104/cm2的密度接种于24孔板中，每孔加入15%FBS，1ng/ml bFGF的低糖DMEM培养液0.8ml；
: L+ T9 D* ^- O7 ^(2)待细胞达80%融合，换为诱导培养液(高糖DMEM, FBS 15%, 胰岛素 10ng/ul)，以后每3～4d换一次液；3 O) ?8 _' {. t0 O% c
(3)2w后进行苏丹Ⅳ染色鉴定。5 v- ^" S* x2 Y$ I3 B
MSC的成骨和成脂肪的检测
& r; c+ n& f, ?茜素S染色方法
7 L9 T0 c: G8 _' ^& J$ h. d  M& Z(1)吸去培养液，PBS洗2次，每次5min;) ^& C% Y2 W* V2 }
(2)90%乙醇固定15min，蒸馏水洗2次；
  m" t9 W: @6 S( f! E(3)茜素S染色8min，蒸馏水洗2次,70%、95%及100%的乙醇分别固定5min,甘油封片。! u# p8 c( Z  z7 ?: ^( X
苏丹Ⅳ染色方法
; c, H4 S  p. Y  |0 Q- X(1)吸去培养液后用PBS洗2次，每次5min；
. e3 z& T4 p( S4 a(2)10%甲醛固定15min，蒸馏水洗2次；
2 i* U+ a5 H$ q/ Q$ e(3)苏丹Ⅳ染色8min，蒸馏水洗2次,苏木精染色10min，自来水洗。甘油封片。

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成软骨细胞的诱导
8 v- m  B) _. U; }; F  K" e选前 三 代 生长良好的MSCs，消化后制成单细胞悬液，以3X 1 0"/ml的密度接4 X2 S. u, N! b  [
种于 细胞瓶中，待细胞达到80-90%融合后，每隔三天换液一次，倒置显微镜下观察 。14 天后 终止诱导。提取总RNA，设计II型前胶元的引物序列，COL(I I) 上游:5 ' -TTC AGC TAT GGA GAT GAC AAT C-3‘，下游:5’-AGA GTC CTA GAG TGA CTGAG-3 ，产物片断4756p，进行RT-PCR扩增。其产物经琼脂糖凝胶电泳后观察，检测II型前胶元mRNA的表达。
8 s- x% j$ s& Y  C软骨细胞诱导液:
  X5 S/ M3 Q% c% _DEM E 高糖 培养液，10%胎牛血清，100u/ml青霉素，l00g/ml链霉素，TGF) ^8 B& c0 e  l: M, B
-P }10ng/ml，抗坏血酸50ug/mla

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体外诱导MSCs向神经细胞分化* D$ ]# g& _3 q3 U: G- l
体外诱导MSCs向神经细胞分化" W5 x. `7 {6 x0 g( ~& C
取体 外扩增至第2代的MScs，以lx105/ml浓度接种于放置有消毒盖玻片9 y5 O4 ?/ F* j8 m: i0 p1 s
的6孔板内，制备细胞爬片。lw后进行诱导:加10ng/1lllEGF+含10%FBs
  E- H7 x5 i2 N/ d% |+ e的培养液预诱导3d，加lm oFLBME+含10%FBS的培养液预诱导ld，24h
: W, Y8 u( p1 j& l: n  W+ W后加1林mo比声JRA+含10%FBs的培养液进行诱导。诱导24h后密切观察，可见多数细胞形成明显的神经元样细胞形态，胞体呈圆形，突起较长，双极或多极形，在突起末端出现分支，部分相邻细胞的突起连接成网。

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选择合适的代数（P3-5代）进行多向诱导分化1 X, a4 x% n; n
成骨诱导培养液的配置：含10%FBS的α-MEM培养液中添加50 μM 抗坏血酸, 10mmβ-磷酸甘油 和 100nm 地塞米松；取P4细胞，按照5×103个/cm2接种6孔板，在生长培养液（α-MEM培养液）中长到基本融合时，更换成成骨诱导培养液，每3d换液，于 7d时进行碱性磷酸酶染色，28d时进行矿化结节的茜素红染色。, n3 D) M: b8 V2 |# L/ d% d
茜素红染色：吸去培养液，PBS冲洗两遍；10%甲醛实温固定15min； ddH2O冲洗两遍； 加入1ml/孔的40mM的茜素红染色液，室温孵育 20min并轻微振荡；吸取未结合的燃料，用ddH2O漂洗并振荡5min重复4次；倾斜放置2min,吸取多余的ddH2O；倒置显微镜观察拍照记录。
( a; s# y# |$ F5 f  g" B+ ~% x: G# ]8 w1 S
成脂诱导培养液的配置：含10%FBS的HG-DMEM培养液中添加1μM地塞米松,10μg/ml胰岛素，200μM吲哚美辛和0.5mM IBMX；取P4细胞，按照2×104个/cm2接种6孔板，在生长培养液（HG-DMEM培养液）中长到基本融合时，更换成脂诱导培养液诱导2d,再用只含有10μg/ml胰岛素的成脂维持液培养1d，如此循环培养至14天，进行油红O染色。, T: l; U; j, j- F0 H) w4 R
油红O染色：吸去培养液，PBS冲洗两遍；27.5%甲醛室温固定20min；ddH2O冲洗三遍，空气干燥；加入0.5%的油红O,室温孵育1h；70%乙醇洗涤3次；倒置显微镜观察拍照记录。

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肝样细胞诱导分化[1~3]
9 v0 r: A) L$ w  Q3 j% W: E" C5 F3 fDMEM中补充bFGF\HGF分别至20ng/ml和10ng/ml，3天换液一次，重新补充因子，在7天左右可以检测得到肝特异基因，蛋白AFP，ALB等的表达
. A/ U. c. m8 y4 Q- g2 y6 N, I% W- B# e4 r# _, j: }
1.Shin-Yeu Onga, Hui Daia, Kam W. Leonga,b, Inducing hepatic differentiation of human mesenchymal stem cells in pellet culture. Biomaterials. 2006, 4087–40970 H( M$ @; ^' I8 W9 y1 w* K, {1 ]  G
2. Taléns-Visconti a, A. Bonora a, R. Jover a, V. Mirabet b, F. Carbonell b.$ c5 f+ I. b! w/ Q& [+ G9 t, @. D
Human mesenchymal stem cells from adipose tissue: DiVerentiation
  u2 k& t2 k4 S6 _  S( _/ I1 [" Yinto hepatic lineage .oxicology in Vitro 21 (2007) 324–329
8 _) r( z' R7 k6 G3.Qing-Jun Zhoua, Yan-Dan Huanga,1, Li-Xin Xiang. In vitro differentiation of embryonic stem cells into hepatocytes induced by fibroblast growth factors. the International Journal of Biochemistry & Cell Biology ,2007,1714–1721

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2.rMSCs成骨和脂肪细胞诱导分化
  T4 p  {, e% K' ?& c+ T# @' S2.1体外定向诱导rMSCs分化为成骨细胞
* O  P- P7 ^; ]以接种密度为4×103/cm2将P3代rMSCs接种于预先置有盖玻片的6孔板内以制备细胞爬片。待细胞融合达80%,吸去孔内培养液,实验组每孔加入成骨条件培养基2mL置培养箱中,隔天换液1次，共诱导3周。对照组加入含10%胎牛血清(FCS)的L-DMEM培养液。3周末应用茜素红S染色法检测钙沉积。) ^" l& v4 k5 `$ ~) H1 e
茜素红S染色法步骤：
. v9 h! U; n" r(1)诱导第21天,吸去成骨条件培养基,PBS洗涤3次
$ t5 Q' J8 ], r8 @6 w(2)茜素红染2min。! Q6 E3 C; J8 [6 F* D
(3)蒸馏水洗5-10s。' u- g4 D, `$ }  O
(4)分化液洗15s。, g4 d- a: X( S  q' `( I
(5)PBS洗涤3次，显微镜下观察并拍照。, k) u  b1 P7 l! q4 [9 ]2 [! K! }: ]& D
2.2体外定向诱导rMSCs分化为脂肪细胞
+ G8 K" r* F1 M" {$ k4 ]以4 ×103/cm2将P3代rMSCs密度接种于预先置有盖玻片的6孔板内以制备细胞爬片。细胞达到80％融合后,加入成脂条件培养基2 mL置培养箱中,隔天换液1次，共诱导3周。对照组加入含10%胎牛血清(FCS)的L-DMEM培养液。3周末应用油红O染色法检测脂滴形成
( ~; ~) l7 K; d, o9 N; H油红O染色法步骤：
  M4 U7 _3 V, `, |5 U3 F(1)细胞爬片用PBS清洗两次，每次5min;
9 Q5 _' Q" ~" H(2)4%多聚甲醛固定15 min;
- {7 j8 S) o+ ]1 `$ R" p3 s(3)PBS漂洗两次，每次5min;
0 u) W% R4 p) x/ M(4)入60%异丙醇漂洗。
9 Q4 q: L' Q' A1 S: @% l(5)入油红O染色15分钟。) |$ c! C- B6 y: }' x5 T% R1 A: |
Devil60%异丙醇漂洗。
$ s5 n, \1 t/ G0 G
; o8 S' y* Q* V/ K7 P3.rMSCs成肌细胞诱导分化
/ S! N7 f" D! `6 V以4 ×103/cm2将P3代rMSCs密度接种于预先置有盖玻片的6孔板内以制备细胞爬片。细胞达到80％融合后,加入含五氮杂胞苷（10umol/L，用 PBS配制）的DMEM2 mL置培养箱培养24小时,然后换用含有2%马血清的DMEM培养基培养7——10天。对照组换用PBS诱导24小时后，加入含2%马血清的L-DMEM 培养液。鉴定：可用MHC,MYOD,MYOGENIN,MHC等肌性标记物行免疫荧光染色。( H  n; V( ?. M. o" r
参考文献：1.Wakitani, S., T. Saito, and A.I. Caplan, Myogenic cells derived from rat bone marrow mesenchymal stem cells exposed to 5-azacytidine. Muscle Nerve, 1995. 18(12): p. 1417-26.

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新西兰大白兔的肌源性干细胞MDSC诱导分化平滑肌细胞SMC! e# ]1 s8 o- x8 n. ^: L6 T( n  N
一、利用差速贴壁法分离兔MDSC及鉴定：) y& d9 [4 J' M8 E
1、根据Qu～1方法改进：麻醉1.5个月龄2.0kg新西兰兔，无菌切取10g大腿肌肉，剪成肉泥并置入15ml无菌离心管中。
. b' Q' U* T1 M/ P: y2、分别用0.2％的ⅩⅠ型胶原酶消化1h、dispase消化45min以及0.1%trypsin消化30min。! c0 y; E: ]# c$ N
3、消化均在37℃恒温培养箱内进行，每次消化指间需离心并取沉淀进行下一步消化。
6 ?7 @  w7 h7 I# e! u4、消化后的沉淀用增殖培养基重悬，并接种在用胶原（0.1％鼠尾胶溶液，自制）包被的培养瓶中，该瓶称为PP1。
* d: ^% s; C; g" {5、PP1于37℃、5％CO2的细胞培养箱中静置过夜，随后将悬液转移到另一个胶原包被的培养瓶中培养，称为PP2。
& Z& c6 V: }7 k) j1 F4 [6、此后连续4d每隔24h将悬液离心、重悬后转移至新的培养瓶中，分别为PP3-PP6。+ R+ q- z$ D* }2 s. _2 ^
7、PP1-PP5弃去不用，PP6用于进一步诱导分化实验，细胞在达到约30％汇合时必须传代，继续接种至胶原预包被的新培养瓶内加入增殖培养基进行培养。7 r, F7 E9 u8 J6 C7 b
8、PP6在汇合度达到30%前进行细胞表型鉴定，分别采用FCM检测desmin、CD45、bcl-2的阳性细胞数百分率。
" {. h/ ]1 O  E9、采用免疫细胞化学检测desmin的表达情况。$ Z. t& J0 _2 G$ j" C# A
二、诱导分化实验：7 q' l5 X" F# U  ]5 S: Y
取PP6进行诱导，采用两种方法：
; n& Y! J+ U$ X: ?, E
) B5 x: R2 p* @: {' N0 S1 ^8 w% D1、共培养诱导：' U! y7 `8 |3 f
细胞消化后离心去上清，用浓度为5mg/L的Hoechst33342（用增殖培养基配制）重悬，避光并在细胞培养箱内孵育20min，随后离心去上清，用增殖培养基重悬，调整密度至1x10~3个/ml，接种到6孔板，每个孔内加入等量的兔阴茎海绵体平滑肌细胞CCSMC进行共培养，2d后进行免疫组化检测α－SMA表达情况。! H# i$ [' d$ n/ X
另设一组对称的未处理组，即PP6单独培养组，以及CCSMC组作为阳性对照，进行激光共聚焦显微镜观察及拍照。
9 J% n( t7 {7 I% r( Q! v& F8 s$ A2、直接诱导：
6 T/ H' t7 M" `: s, v0 G6 b细胞消化下来后接种到6孔板，并且添加VEGF，使其在每孔的终浓度为25ug/L，置入培养箱，2d后进行免疫细胞化学以及Western blot法检测α－SMA表达情况（选用GAPDH作为内参）。# P( `7 j- j, a/ }; a
同时另设一对称的未处理组，即未添加VEGF的PP6单独培养，并设立成纤维细胞组作为阴性对照，以及CCSMC组作为阳性对照。- @  x: x! B+ U% l

* }. w$ l8 w0 ~: `7 V5 @: Y增殖培养基：20％的胎牛血清、20％马血清、80％DMED-LG0 M/ q9 }4 J. b- X+ h

9 o) [0 g' g; g* B5 M% ^' E) i0 H- o% K/ i. Y
Qu Z,Balkir L,Van Deutekom JC,et al. Development of approaches to improve cell survival in myoblast transfer therapy.J Cell Biol.1998,142:1257-1267

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CD34+CD38-的干细胞向 粒系的诱导分化:
* _3 |% b! m% t. c/ N, ?- X细胞培养体系为lml,200微升的胎牛血清,800微升的IMEM,SCF 10ng, IL-3 5ng,
0 H' o' B. V3 WGM-CSF 5ng, G-CSF 5000U,前面三个因子是peprotech公司的,后一细胞因子就是临床的瑞白.在诱导的第七天可见所有的细胞都表达CD33,在诱导的14天可见90%的细胞CD15明显表达!

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脐血造血干细胞诱导分化为巨核细胞2 G- c7 q% P4 G7 e) ~# [: C2 }
x123u：脐血造血干细胞诱导分化为巨核细胞( q1 B1 \. [$ Z
4 I; V' H- R' B- h* b6 `4 o
1．用含肝素抗凝的无菌干燥瓶收集，采血量为80-100 ml。
8 f$ w3 B5 P; h) n* x; G9 o7 x6 F& L; g3 P
2．细胞因子：TPO、FLT3-L 、IL-3、IL-6和SCF。
' Y( O: w/ w0 W
7 p0 i/ R+ K- E' e3．应用免疫磁珠MACS方法分离脐血CD34＋细胞，然后取部分细胞进行流式细胞仪测定、鉴定和分离纯度。1 Y; u" h* @) `' R4 I. m( D6 D
' B2 `& z$ G, a+ Q3 E/ t$ s
4．诱导方案：CD41＋细胞的体外诱导扩增用含10％ FCS和5×10 mol/L二巯基乙醇的IMDM，将CD34＋细胞浓度调整为2×10/ml，加入24孔板，每孔终体积为1mL。细胞因子组合为：TPO+SCF+ IL3+IL6，细胞因子的终浓度为：IL3 10 ng/ml，IL-6 10 ng/ml，SCF 50 ng/ml，TPO 10 ng/ml，FLT-3L 10 ng/ml。将上述扩增体系置37度饱和湿度CO2培养箱中培养，每3天半量换液1次，添加全量的造血生长因子，培养3周，在培养的第7天或14天测定培养体系的总细胞数，用流式细胞仪测定 CD41＋细胞的含量即为巨核细胞。5 |8 V; Q& A5 U
) x" \/ f& ]5 A# J7 j6 R) [* G1 X
5．甲基纤维素半固体培养法培养对CD41＋细胞进行集落培养以进一步鉴定。& G5 ?3 z1 Y& I. ]0 S
* m' g8 W2 Q' v/ q) I
参考文献：6 b: J) O7 U) F5 e. T# R
1.Williams JL．Pipia GG ，Datta NS，et al. Thrombopoietin rquires additional mgakaryocyte-active cytokines for optimal，ex vivo expansion of megakaryocyte precursor cyells．Blood，1998；91：4118-4l26.
; K1 ~0 G( B: F' S& A5 C) w2.Li K．Yan g M，Lam AC，et al. Efects offit3 ligan d in combination with TPO on the expan sion of megakaryocytic progenitors．Cell Transplant，2000；9：125-131.

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zeronepl  l1 R) I% I& F4 p5 }% C5 v5 |$ j- w
1.1 BMSCs向成骨细胞诱导分化7 r* `3 X2 G: g! x0 W2 A
诱导剂主要有10-8mol/L地塞米松、50μg/ml抗坏血酸、10mmol/L β-甘油磷酸钠、FBS和DMEM-LG液。
7 H$ G  h  k$ K3 O% I. H  {1.2 BMSCs向软骨细胞诱导分化
1 R3 m6 t7 F1 T7 O8 Q8 H" i9 }( \诱导剂主要有胰岛素、转铁蛋白、牛血清白蛋白、丙酮酸钠、亚油酸、维生素C、地塞米松、TGF-β。- R9 `" i( E" m5 s5 R- l% B( s! k
1.3 BMSCs向脂肪细胞诱导分化, P( O% A5 a9 G! ]- b/ a& R
诱导剂主要有1-甲基-3-异丁基黄嘌呤、胰岛素、地塞米松和消炎痛等。: I% A6 f8 W2 b) p" E" H" A
1.4 BMSCs向神经细胞诱导分化
# P4 d# J7 Q9 _7 \诱导剂主要有β-巯基乙醇、二甲基亚砜、丁化羟基苯甲醚。
2 j% ~9 j6 H1 m( X1 c1.5 BMSCs向内皮细胞诱导分化7 j# F% b" e; k) B9 [
诱导剂主要有胰岛素、转铁蛋白、硒、牛血清白蛋白、地塞米松、2-磷酸抗坏血酸及微量VEGF等。4 q& W6 X5 G' A; s1 Q6 ]! ^$ E
1.6 BMSCs向肝细胞诱导分化
) ^" H0 d3 z0 i2 y) `1.7 BMSCs向心肌细胞诱导分化
% X3 w: Z/ x. a( @! P! N诱导剂主要有5-氮胞苷。! Z( T+ P+ ?" i) S5 ?+ T
1.8 BMSCs向胰岛细胞诱导分化7 j7 g# P! b/ z
诱导剂主要有β-巯基乙醇、尼克酰胺、B27。