MSC诱导分化专题

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样本:
" {0 _* B/ e0 h0 u& DMSC向成骨细胞的诱导分化
" e  Y* E" E1 g9 }! c5 r(1)取P2代MSC在传代的同时以2×104/cm2的密度接种于24孔板中，每孔加入15%FBS，1ng/ml bFGF的低糖DMEM培养液0.8ml；
. T4 ?% k6 v7 |( ]# f(2)待细胞达80%融合，换为诱导培养液(高糖DMEM, 地塞米松 10-8M, β-磷酸甘油1.5mg/ml,抗坏血酸50μg/ml)，以后每3～4d换一次液；
2 B- d% q5 Q/ D(3)2w后进行茜素S染色鉴定。. f# ?' N9 H+ ?- r
3.2.3 MSC向脂肪细胞的诱导分化8 A  X( p# ~6 S) Y7 b( v
(1)取P2代MSC在传代的同时以2×104/cm2的密度接种于24孔板中，每孔加入15%FBS，1ng/ml bFGF的低糖DMEM培养液0.8ml；
8 W4 l2 F- w. |  ~( @% s* Q/ _/ Z(2)待细胞达80%融合，换为诱导培养液(高糖DMEM, FBS 15%, 胰岛素 10ng/ul)，以后每3～4d换一次液；$ e' p7 {( y% t+ B' T# b
(3)2w后进行苏丹Ⅳ染色鉴定。  |! S# j, m, H& v8 g' O2 H
MSC的成骨和成脂肪的检测$ }4 B9 r& M4 I0 n1 c
茜素S染色方法* ~/ V: `4 U/ j) D4 W9 P
(1)吸去培养液，PBS洗2次，每次5min;2 g9 F( G/ H6 K. X% g  S3 V
(2)90%乙醇固定15min，蒸馏水洗2次；
" Q: l8 L* s7 Z. x2 ]5 F2 P(3)茜素S染色8min，蒸馏水洗2次,70%、95%及100%的乙醇分别固定5min,甘油封片。
; M% W7 c9 I2 k" a0 r$ o: B苏丹Ⅳ染色方法
2 i2 Q3 n+ ]" y3 `(1)吸去培养液后用PBS洗2次，每次5min；
4 J5 R; P; @% g8 a! s(2)10%甲醛固定15min，蒸馏水洗2次；( y. V. g" P4 g% O" _, h+ Z* r
(3)苏丹Ⅳ染色8min，蒸馏水洗2次,苏木精染色10min，自来水洗。甘油封片。

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成软骨细胞的诱导
* L4 i8 T5 W3 A; a3 ^选前 三 代 生长良好的MSCs，消化后制成单细胞悬液，以3X 1 0"/ml的密度接
$ g2 ]  y$ Q! p: Z, R种于 细胞瓶中，待细胞达到80-90%融合后，每隔三天换液一次，倒置显微镜下观察 。14 天后 终止诱导。提取总RNA，设计II型前胶元的引物序列，COL(I I) 上游:5 ' -TTC AGC TAT GGA GAT GAC AAT C-3‘，下游:5’-AGA GTC CTA GAG TGA CTGAG-3 ，产物片断4756p，进行RT-PCR扩增。其产物经琼脂糖凝胶电泳后观察，检测II型前胶元mRNA的表达。
9 a% |4 b5 [- z- s, E6 h软骨细胞诱导液:9 l, O/ |# T/ S# `
DEM E 高糖 培养液，10%胎牛血清，100u/ml青霉素，l00g/ml链霉素，TGF3 l1 a' W3 u, n7 z$ b# s
-P }10ng/ml，抗坏血酸50ug/mla

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体外诱导MSCs向神经细胞分化! b0 D0 H, `, q% Y/ [* x' K) Z# D
体外诱导MSCs向神经细胞分化2 Y! m, s% S$ P3 [% v
取体 外扩增至第2代的MScs，以lx105/ml浓度接种于放置有消毒盖玻片
2 k% @; K0 \, \的6孔板内，制备细胞爬片。lw后进行诱导:加10ng/1lllEGF+含10%FBs, U/ v" G) ]" @! T: v6 X% k
的培养液预诱导3d，加lm oFLBME+含10%FBS的培养液预诱导ld，24h
5 Q0 k$ X7 e$ a: B后加1林mo比声JRA+含10%FBs的培养液进行诱导。诱导24h后密切观察，可见多数细胞形成明显的神经元样细胞形态，胞体呈圆形，突起较长，双极或多极形，在突起末端出现分支，部分相邻细胞的突起连接成网。

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选择合适的代数（P3-5代）进行多向诱导分化
7 o  O5 j2 D' T& `/ o2 K# b成骨诱导培养液的配置：含10%FBS的α-MEM培养液中添加50 μM 抗坏血酸, 10mmβ-磷酸甘油 和 100nm 地塞米松；取P4细胞，按照5×103个/cm2接种6孔板，在生长培养液（α-MEM培养液）中长到基本融合时，更换成成骨诱导培养液，每3d换液，于 7d时进行碱性磷酸酶染色，28d时进行矿化结节的茜素红染色。
1 D0 T4 h0 c6 C6 E* C' W+ A- {茜素红染色：吸去培养液，PBS冲洗两遍；10%甲醛实温固定15min； ddH2O冲洗两遍； 加入1ml/孔的40mM的茜素红染色液，室温孵育 20min并轻微振荡；吸取未结合的燃料，用ddH2O漂洗并振荡5min重复4次；倾斜放置2min,吸取多余的ddH2O；倒置显微镜观察拍照记录。
. `' X* R: C8 X/ H- G% j& e& o) ]; C8 g! ^! o
成脂诱导培养液的配置：含10%FBS的HG-DMEM培养液中添加1μM地塞米松,10μg/ml胰岛素，200μM吲哚美辛和0.5mM IBMX；取P4细胞，按照2×104个/cm2接种6孔板，在生长培养液（HG-DMEM培养液）中长到基本融合时，更换成脂诱导培养液诱导2d,再用只含有10μg/ml胰岛素的成脂维持液培养1d，如此循环培养至14天，进行油红O染色。
/ ]4 k, ], Q1 |1 ^9 k& P9 p油红O染色：吸去培养液，PBS冲洗两遍；27.5%甲醛室温固定20min；ddH2O冲洗三遍，空气干燥；加入0.5%的油红O,室温孵育1h；70%乙醇洗涤3次；倒置显微镜观察拍照记录。

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肝样细胞诱导分化[1~3]
+ H& U: u9 M9 c5 E+ LDMEM中补充bFGF\HGF分别至20ng/ml和10ng/ml，3天换液一次，重新补充因子，在7天左右可以检测得到肝特异基因，蛋白AFP，ALB等的表达
! V: D% A+ F: I2 W3 l/ x0 V$ j; a+ }; J! G7 T
1.Shin-Yeu Onga, Hui Daia, Kam W. Leonga,b, Inducing hepatic differentiation of human mesenchymal stem cells in pellet culture. Biomaterials. 2006, 4087–4097
& l  e9 C  B; a. V) y2. Taléns-Visconti a, A. Bonora a, R. Jover a, V. Mirabet b, F. Carbonell b.
- L0 u2 f# ]1 T4 l4 w* qHuman mesenchymal stem cells from adipose tissue: DiVerentiation; L( |, X) h7 _" \! Y8 t
into hepatic lineage .oxicology in Vitro 21 (2007) 324–329
2 e- X9 u- p2 Q: @- N5 {% v6 j3.Qing-Jun Zhoua, Yan-Dan Huanga,1, Li-Xin Xiang. In vitro differentiation of embryonic stem cells into hepatocytes induced by fibroblast growth factors. the International Journal of Biochemistry & Cell Biology ,2007,1714–1721

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2.rMSCs成骨和脂肪细胞诱导分化
# e( \9 C0 R8 Z( s/ M, q/ Q2.1体外定向诱导rMSCs分化为成骨细胞
" J# ^4 g2 N1 r# j以接种密度为4×103/cm2将P3代rMSCs接种于预先置有盖玻片的6孔板内以制备细胞爬片。待细胞融合达80%,吸去孔内培养液,实验组每孔加入成骨条件培养基2mL置培养箱中,隔天换液1次，共诱导3周。对照组加入含10%胎牛血清(FCS)的L-DMEM培养液。3周末应用茜素红S染色法检测钙沉积。# d$ S: a/ b9 T- g$ J
茜素红S染色法步骤：
3 `8 I- c) ^4 I- J9 J% A8 f(1)诱导第21天,吸去成骨条件培养基,PBS洗涤3次
- J3 @- V* U  y/ o# y(2)茜素红染2min。
/ b' H/ j# g' ~9 R0 I3 L% P(3)蒸馏水洗5-10s。
( ?- D* Z2 S8 v# [# E(4)分化液洗15s。
- f7 O. D$ l+ q$ L5 I/ E3 w(5)PBS洗涤3次，显微镜下观察并拍照。
9 ]9 j: F5 o( S/ u# a2.2体外定向诱导rMSCs分化为脂肪细胞
8 r/ P- n1 O# x% t7 F以4 ×103/cm2将P3代rMSCs密度接种于预先置有盖玻片的6孔板内以制备细胞爬片。细胞达到80％融合后,加入成脂条件培养基2 mL置培养箱中,隔天换液1次，共诱导3周。对照组加入含10%胎牛血清(FCS)的L-DMEM培养液。3周末应用油红O染色法检测脂滴形成5 E  E" H4 }: p2 i$ S
油红O染色法步骤：6 K. U! z3 s; L# ]4 y
(1)细胞爬片用PBS清洗两次，每次5min;
3 y+ p' v8 Y) ~(2)4%多聚甲醛固定15 min;
+ u) I" C" G5 e: q(3)PBS漂洗两次，每次5min;9 S4 [) ]1 t% B, @% U; o
(4)入60%异丙醇漂洗。
1 I7 x1 c; R1 q2 t0 a; B(5)入油红O染色15分钟。
$ R( d0 P& d* c$ A+ p  [0 Y5 HDevil60%异丙醇漂洗。2 a8 q+ L3 J# e# ]5 |  P

+ f* I1 d! P1 a4 U3 x# a; x$ H3.rMSCs成肌细胞诱导分化. C1 S% z- \6 I; {$ T
以4 ×103/cm2将P3代rMSCs密度接种于预先置有盖玻片的6孔板内以制备细胞爬片。细胞达到80％融合后,加入含五氮杂胞苷（10umol/L，用 PBS配制）的DMEM2 mL置培养箱培养24小时,然后换用含有2%马血清的DMEM培养基培养7——10天。对照组换用PBS诱导24小时后，加入含2%马血清的L-DMEM 培养液。鉴定：可用MHC,MYOD,MYOGENIN,MHC等肌性标记物行免疫荧光染色。
& V! i' K0 K# ?  l. s  T# z/ B7 Z参考文献：1.Wakitani, S., T. Saito, and A.I. Caplan, Myogenic cells derived from rat bone marrow mesenchymal stem cells exposed to 5-azacytidine. Muscle Nerve, 1995. 18(12): p. 1417-26.

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新西兰大白兔的肌源性干细胞MDSC诱导分化平滑肌细胞SMC4 n  v: Y* a; H5 \( p) V4 V
一、利用差速贴壁法分离兔MDSC及鉴定：! U5 P5 J7 P% E) u
1、根据Qu～1方法改进：麻醉1.5个月龄2.0kg新西兰兔，无菌切取10g大腿肌肉，剪成肉泥并置入15ml无菌离心管中。
* I4 Y' d" w7 P1 ?& d0 Z" k0 W+ A$ h2、分别用0.2％的ⅩⅠ型胶原酶消化1h、dispase消化45min以及0.1%trypsin消化30min。
. u2 x1 r, R9 Y: m! H( _3、消化均在37℃恒温培养箱内进行，每次消化指间需离心并取沉淀进行下一步消化。& N1 X6 ~( Z( j5 x1 Q
4、消化后的沉淀用增殖培养基重悬，并接种在用胶原（0.1％鼠尾胶溶液，自制）包被的培养瓶中，该瓶称为PP1。
& E( B& b. k- {; p; g( u8 f5、PP1于37℃、5％CO2的细胞培养箱中静置过夜，随后将悬液转移到另一个胶原包被的培养瓶中培养，称为PP2。
* g0 X9 K( Y( u% O4 L6 ^5 k6、此后连续4d每隔24h将悬液离心、重悬后转移至新的培养瓶中，分别为PP3-PP6。
$ T* i8 F$ J; t) R7、PP1-PP5弃去不用，PP6用于进一步诱导分化实验，细胞在达到约30％汇合时必须传代，继续接种至胶原预包被的新培养瓶内加入增殖培养基进行培养。$ {$ O: D2 f# C  i
8、PP6在汇合度达到30%前进行细胞表型鉴定，分别采用FCM检测desmin、CD45、bcl-2的阳性细胞数百分率。% k# C: F) U+ ~8 w) m
9、采用免疫细胞化学检测desmin的表达情况。
0 i1 Y$ V( e& m8 g/ P  r二、诱导分化实验：* Y. k7 _0 Z9 K
取PP6进行诱导，采用两种方法：
- Z+ q* A. U: I
' o3 g8 Q% P2 H8 a4 W1、共培养诱导：5 o# c% `' c; M( P9 w
细胞消化后离心去上清，用浓度为5mg/L的Hoechst33342（用增殖培养基配制）重悬，避光并在细胞培养箱内孵育20min，随后离心去上清，用增殖培养基重悬，调整密度至1x10~3个/ml，接种到6孔板，每个孔内加入等量的兔阴茎海绵体平滑肌细胞CCSMC进行共培养，2d后进行免疫组化检测α－SMA表达情况。) M) u2 g6 [  H0 @
另设一组对称的未处理组，即PP6单独培养组，以及CCSMC组作为阳性对照，进行激光共聚焦显微镜观察及拍照。
  _/ ~. O8 y/ D/ X/ b# O( w2、直接诱导：
9 s# q" u& G. W: a3 S, z: h# c细胞消化下来后接种到6孔板，并且添加VEGF，使其在每孔的终浓度为25ug/L，置入培养箱，2d后进行免疫细胞化学以及Western blot法检测α－SMA表达情况（选用GAPDH作为内参）。
$ {5 j- C. M# J& U7 E同时另设一对称的未处理组，即未添加VEGF的PP6单独培养，并设立成纤维细胞组作为阴性对照，以及CCSMC组作为阳性对照。
1 \" |! F$ t$ W' E( H% k0 W0 u' O) V5 s6 x; a* S
增殖培养基：20％的胎牛血清、20％马血清、80％DMED-LG6 z1 x) f/ m  r
3 i& l3 M( _* l
  T0 I3 t. I/ I7 v3 N
Qu Z,Balkir L,Van Deutekom JC,et al. Development of approaches to improve cell survival in myoblast transfer therapy.J Cell Biol.1998,142:1257-1267

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CD34+CD38-的干细胞向 粒系的诱导分化:! F* l, i$ h# O3 U
细胞培养体系为lml,200微升的胎牛血清,800微升的IMEM,SCF 10ng, IL-3 5ng,7 q1 |0 `3 f- T1 k. M! c1 f
GM-CSF 5ng, G-CSF 5000U,前面三个因子是peprotech公司的,后一细胞因子就是临床的瑞白.在诱导的第七天可见所有的细胞都表达CD33,在诱导的14天可见90%的细胞CD15明显表达!

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脐血造血干细胞诱导分化为巨核细胞# l$ s; F8 e: ~# a8 p! R0 _
x123u：脐血造血干细胞诱导分化为巨核细胞
2 R) J! C8 A0 Q- P! A% U- p4 d( I% i9 }% J+ b
1．用含肝素抗凝的无菌干燥瓶收集，采血量为80-100 ml。
6 ]  Z2 y; O, u0 u7 f& K$ M% l  K. i* D# a
2．细胞因子：TPO、FLT3-L 、IL-3、IL-6和SCF。
% q5 F* ]5 D8 m1 n; A4 u( o! P) m# S! t
3．应用免疫磁珠MACS方法分离脐血CD34＋细胞，然后取部分细胞进行流式细胞仪测定、鉴定和分离纯度。, r( \5 T2 @/ e3 ^5 }3 s

$ J) D. a8 U$ e0 w; x4．诱导方案：CD41＋细胞的体外诱导扩增用含10％ FCS和5×10 mol/L二巯基乙醇的IMDM，将CD34＋细胞浓度调整为2×10/ml，加入24孔板，每孔终体积为1mL。细胞因子组合为：TPO+SCF+ IL3+IL6，细胞因子的终浓度为：IL3 10 ng/ml，IL-6 10 ng/ml，SCF 50 ng/ml，TPO 10 ng/ml，FLT-3L 10 ng/ml。将上述扩增体系置37度饱和湿度CO2培养箱中培养，每3天半量换液1次，添加全量的造血生长因子，培养3周，在培养的第7天或14天测定培养体系的总细胞数，用流式细胞仪测定 CD41＋细胞的含量即为巨核细胞。& A0 P5 j6 L  f' j

) D  L, U! j- z8 o& I6 |5．甲基纤维素半固体培养法培养对CD41＋细胞进行集落培养以进一步鉴定。0 Z4 J: Z0 @" \

3 |. H" V! ^# B& E6 B2 t参考文献：
) o% P9 r# G, l2 h* f' c1.Williams JL．Pipia GG ，Datta NS，et al. Thrombopoietin rquires additional mgakaryocyte-active cytokines for optimal，ex vivo expansion of megakaryocyte precursor cyells．Blood，1998；91：4118-4l26.
, \2 e4 s& `$ y' U) s* ^2.Li K．Yan g M，Lam AC，et al. Efects offit3 ligan d in combination with TPO on the expan sion of megakaryocytic progenitors．Cell Transplant，2000；9：125-131.

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zeronepl+ s; I# d) D9 p# x( H- l1 U
1.1 BMSCs向成骨细胞诱导分化2 n. Z; z6 R/ E" {+ y
诱导剂主要有10-8mol/L地塞米松、50μg/ml抗坏血酸、10mmol/L β-甘油磷酸钠、FBS和DMEM-LG液。9 G  l  P/ t' d/ \6 ^; o
1.2 BMSCs向软骨细胞诱导分化
  F5 Q% z2 j) I0 Y0 k诱导剂主要有胰岛素、转铁蛋白、牛血清白蛋白、丙酮酸钠、亚油酸、维生素C、地塞米松、TGF-β。
! m/ {& S0 K7 \$ }3 E1.3 BMSCs向脂肪细胞诱导分化4 L  @1 w0 t& R  ]/ ^- v3 |
诱导剂主要有1-甲基-3-异丁基黄嘌呤、胰岛素、地塞米松和消炎痛等。
7 K! D- Q0 \+ V0 B6 P3 W7 c1 T1.4 BMSCs向神经细胞诱导分化
$ l3 J% q4 J. u: ~4 \4 V# K5 K诱导剂主要有β-巯基乙醇、二甲基亚砜、丁化羟基苯甲醚。% G2 V+ j5 P& `
1.5 BMSCs向内皮细胞诱导分化8 ?# x5 n3 Y% H5 b) C: s
诱导剂主要有胰岛素、转铁蛋白、硒、牛血清白蛋白、地塞米松、2-磷酸抗坏血酸及微量VEGF等。
$ Q  ~, `2 ~  ]# F, ^7 W; U1.6 BMSCs向肝细胞诱导分化
$ b- q- |8 `$ o1.7 BMSCs向心肌细胞诱导分化
* E" @  N" W- A" a0 T7 n诱导剂主要有5-氮胞苷。
3 [6 S% k+ y; K% U1.8 BMSCs向胰岛细胞诱导分化
0 |- i9 a# r2 y; A/ m诱导剂主要有β-巯基乙醇、尼克酰胺、B27。