MSC诱导分化专题

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样本:( n; _. g9 z  u1 ^4 {; S1 x: G
MSC向成骨细胞的诱导分化
% B5 W) ]& W# P: ]9 n5 P% j(1)取P2代MSC在传代的同时以2×104/cm2的密度接种于24孔板中，每孔加入15%FBS，1ng/ml bFGF的低糖DMEM培养液0.8ml；
) o5 B% V. `( o; R9 J9 c(2)待细胞达80%融合，换为诱导培养液(高糖DMEM, 地塞米松 10-8M, β-磷酸甘油1.5mg/ml,抗坏血酸50μg/ml)，以后每3～4d换一次液；
0 r( n( `( q- ?2 C$ f& d) C(3)2w后进行茜素S染色鉴定。
9 V4 V9 z4 u: Y* Y3 a2 z3.2.3 MSC向脂肪细胞的诱导分化6 `* i/ t' J& ~# A* l
(1)取P2代MSC在传代的同时以2×104/cm2的密度接种于24孔板中，每孔加入15%FBS，1ng/ml bFGF的低糖DMEM培养液0.8ml；7 A" o- Z" e, T- |  C6 K
(2)待细胞达80%融合，换为诱导培养液(高糖DMEM, FBS 15%, 胰岛素 10ng/ul)，以后每3～4d换一次液；+ q. w+ M% Y( ?3 e5 W6 j# G1 t
(3)2w后进行苏丹Ⅳ染色鉴定。
! Y6 V6 P: c5 f8 \' @MSC的成骨和成脂肪的检测
5 U! d% r" H$ S  J! j茜素S染色方法
" g2 L; Z# f. `0 a6 ?, k2 q4 k& y(1)吸去培养液，PBS洗2次，每次5min;4 a% e9 f9 Q4 m: _: b1 t- L& p( x
(2)90%乙醇固定15min，蒸馏水洗2次；) o8 B# i2 h3 F* r" g( ~
(3)茜素S染色8min，蒸馏水洗2次,70%、95%及100%的乙醇分别固定5min,甘油封片。
+ |' v# O$ i! e9 Z苏丹Ⅳ染色方法
+ K7 k( x4 }4 y/ l# `) H(1)吸去培养液后用PBS洗2次，每次5min；- h  Y1 v$ A& A/ \0 b
(2)10%甲醛固定15min，蒸馏水洗2次；: }& o* j; @7 p' |
(3)苏丹Ⅳ染色8min，蒸馏水洗2次,苏木精染色10min，自来水洗。甘油封片。

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成软骨细胞的诱导
  G& \) h, n8 L7 F- b3 y* d- H选前 三 代 生长良好的MSCs，消化后制成单细胞悬液，以3X 1 0"/ml的密度接
' T8 c, S9 e4 |% j9 J& }种于 细胞瓶中，待细胞达到80-90%融合后，每隔三天换液一次，倒置显微镜下观察 。14 天后 终止诱导。提取总RNA，设计II型前胶元的引物序列，COL(I I) 上游:5 ' -TTC AGC TAT GGA GAT GAC AAT C-3‘，下游:5’-AGA GTC CTA GAG TGA CTGAG-3 ，产物片断4756p，进行RT-PCR扩增。其产物经琼脂糖凝胶电泳后观察，检测II型前胶元mRNA的表达。8 _5 I4 R& r* ~- j. g& k
软骨细胞诱导液:
) Y- E* X+ M0 j6 y& F1 ~DEM E 高糖 培养液，10%胎牛血清，100u/ml青霉素，l00g/ml链霉素，TGF
2 ]7 N1 q  g$ d  S5 t8 T* }-P }10ng/ml，抗坏血酸50ug/mla

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体外诱导MSCs向神经细胞分化
# f- i1 Q1 Y, c- o9 ]体外诱导MSCs向神经细胞分化: G5 @, J: K* j! }2 r
取体 外扩增至第2代的MScs，以lx105/ml浓度接种于放置有消毒盖玻片
3 T3 `0 X% Z0 ?. P8 r4 s的6孔板内，制备细胞爬片。lw后进行诱导:加10ng/1lllEGF+含10%FBs# s, x' i6 h2 W. k. }0 I
的培养液预诱导3d，加lm oFLBME+含10%FBS的培养液预诱导ld，24h
$ I( a: v, p8 d* W( W* u9 J后加1林mo比声JRA+含10%FBs的培养液进行诱导。诱导24h后密切观察，可见多数细胞形成明显的神经元样细胞形态，胞体呈圆形，突起较长，双极或多极形，在突起末端出现分支，部分相邻细胞的突起连接成网。

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选择合适的代数（P3-5代）进行多向诱导分化
1 ?* t4 S' O' r: q  P. h成骨诱导培养液的配置：含10%FBS的α-MEM培养液中添加50 μM 抗坏血酸, 10mmβ-磷酸甘油 和 100nm 地塞米松；取P4细胞，按照5×103个/cm2接种6孔板，在生长培养液（α-MEM培养液）中长到基本融合时，更换成成骨诱导培养液，每3d换液，于 7d时进行碱性磷酸酶染色，28d时进行矿化结节的茜素红染色。4 K$ `' H1 W  f0 U5 E# m8 {
茜素红染色：吸去培养液，PBS冲洗两遍；10%甲醛实温固定15min； ddH2O冲洗两遍； 加入1ml/孔的40mM的茜素红染色液，室温孵育 20min并轻微振荡；吸取未结合的燃料，用ddH2O漂洗并振荡5min重复4次；倾斜放置2min,吸取多余的ddH2O；倒置显微镜观察拍照记录。+ b+ N: z( ~. [
$ a0 ^. V% L3 d, Y: i" s! R) d
成脂诱导培养液的配置：含10%FBS的HG-DMEM培养液中添加1μM地塞米松,10μg/ml胰岛素，200μM吲哚美辛和0.5mM IBMX；取P4细胞，按照2×104个/cm2接种6孔板，在生长培养液（HG-DMEM培养液）中长到基本融合时，更换成脂诱导培养液诱导2d,再用只含有10μg/ml胰岛素的成脂维持液培养1d，如此循环培养至14天，进行油红O染色。# c4 ^# S+ j8 E% x7 M7 }6 M
油红O染色：吸去培养液，PBS冲洗两遍；27.5%甲醛室温固定20min；ddH2O冲洗三遍，空气干燥；加入0.5%的油红O,室温孵育1h；70%乙醇洗涤3次；倒置显微镜观察拍照记录。

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肝样细胞诱导分化[1~3]
2 B# Q3 [- O+ x' M1 A3 [DMEM中补充bFGF\HGF分别至20ng/ml和10ng/ml，3天换液一次，重新补充因子，在7天左右可以检测得到肝特异基因，蛋白AFP，ALB等的表达0 E! b' q' ?; R6 J" G) _7 U: a
) t7 |- |  Y/ D: z& I! c" l
1.Shin-Yeu Onga, Hui Daia, Kam W. Leonga,b, Inducing hepatic differentiation of human mesenchymal stem cells in pellet culture. Biomaterials. 2006, 4087–4097; o( t! l" f6 }9 ^0 O0 Q) |7 S( }
2. Taléns-Visconti a, A. Bonora a, R. Jover a, V. Mirabet b, F. Carbonell b.8 T# d1 V4 k/ A; Y8 F% u$ _' q
Human mesenchymal stem cells from adipose tissue: DiVerentiation$ a/ Y$ T' d6 z, ]5 y% }! x
into hepatic lineage .oxicology in Vitro 21 (2007) 324–329
2 @2 O0 r# H3 J! j6 T/ }# B3.Qing-Jun Zhoua, Yan-Dan Huanga,1, Li-Xin Xiang. In vitro differentiation of embryonic stem cells into hepatocytes induced by fibroblast growth factors. the International Journal of Biochemistry & Cell Biology ,2007,1714–1721

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2.rMSCs成骨和脂肪细胞诱导分化
# ?8 U* y6 E3 N# B/ d6 ?2.1体外定向诱导rMSCs分化为成骨细胞& ^) s! V5 J/ ~$ V
以接种密度为4×103/cm2将P3代rMSCs接种于预先置有盖玻片的6孔板内以制备细胞爬片。待细胞融合达80%,吸去孔内培养液,实验组每孔加入成骨条件培养基2mL置培养箱中,隔天换液1次，共诱导3周。对照组加入含10%胎牛血清(FCS)的L-DMEM培养液。3周末应用茜素红S染色法检测钙沉积。
3 w4 i% A# {4 x4 b# \3 F- [4 L茜素红S染色法步骤：' D+ `% P& `. J* q/ o
(1)诱导第21天,吸去成骨条件培养基,PBS洗涤3次
& w9 Z, B/ q1 n; s0 l(2)茜素红染2min。! v+ N$ |$ P1 S* w
(3)蒸馏水洗5-10s。
0 J; G* ~  o* N( `2 C(4)分化液洗15s。
  n; o* t( o; r(5)PBS洗涤3次，显微镜下观察并拍照。
. b8 z$ G$ g, b3 ^, v2.2体外定向诱导rMSCs分化为脂肪细胞* W' l5 n- |+ i" m1 ~7 }
以4 ×103/cm2将P3代rMSCs密度接种于预先置有盖玻片的6孔板内以制备细胞爬片。细胞达到80％融合后,加入成脂条件培养基2 mL置培养箱中,隔天换液1次，共诱导3周。对照组加入含10%胎牛血清(FCS)的L-DMEM培养液。3周末应用油红O染色法检测脂滴形成3 T# t8 f; o7 I
油红O染色法步骤：3 x5 R0 R! H7 K  ?
(1)细胞爬片用PBS清洗两次，每次5min;9 E% S, S3 T) @! C1 o
(2)4%多聚甲醛固定15 min;
; Y2 X, s' Q+ L+ Z(3)PBS漂洗两次，每次5min;
1 l" f" z3 T5 B8 t(4)入60%异丙醇漂洗。
" X9 }3 X) Q% X0 O1 \. m- y" H(5)入油红O染色15分钟。
0 y/ t+ g7 B5 C+ _Devil60%异丙醇漂洗。1 C- \4 H1 s" u+ U$ ~' H1 E
1 `4 Z/ g6 B! l- R# }# U0 M
3.rMSCs成肌细胞诱导分化* D  u* |: [& W6 K; d
以4 ×103/cm2将P3代rMSCs密度接种于预先置有盖玻片的6孔板内以制备细胞爬片。细胞达到80％融合后,加入含五氮杂胞苷（10umol/L，用 PBS配制）的DMEM2 mL置培养箱培养24小时,然后换用含有2%马血清的DMEM培养基培养7——10天。对照组换用PBS诱导24小时后，加入含2%马血清的L-DMEM 培养液。鉴定：可用MHC,MYOD,MYOGENIN,MHC等肌性标记物行免疫荧光染色。
7 S5 U6 G. V1 X9 @4 o% b8 V参考文献：1.Wakitani, S., T. Saito, and A.I. Caplan, Myogenic cells derived from rat bone marrow mesenchymal stem cells exposed to 5-azacytidine. Muscle Nerve, 1995. 18(12): p. 1417-26.

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新西兰大白兔的肌源性干细胞MDSC诱导分化平滑肌细胞SMC
( T! L! \' \, S& B& x一、利用差速贴壁法分离兔MDSC及鉴定：
  P$ W7 B2 f9 g+ W* f) s1、根据Qu～1方法改进：麻醉1.5个月龄2.0kg新西兰兔，无菌切取10g大腿肌肉，剪成肉泥并置入15ml无菌离心管中。, k! ?8 J& m) I" z9 v# J: m/ m3 F
2、分别用0.2％的ⅩⅠ型胶原酶消化1h、dispase消化45min以及0.1%trypsin消化30min。
  ?; b% t1 [# ]3 X! v3、消化均在37℃恒温培养箱内进行，每次消化指间需离心并取沉淀进行下一步消化。
; j! O. _& G5 b. Y4、消化后的沉淀用增殖培养基重悬，并接种在用胶原（0.1％鼠尾胶溶液，自制）包被的培养瓶中，该瓶称为PP1。8 \+ d' [7 ~' Q: D
5、PP1于37℃、5％CO2的细胞培养箱中静置过夜，随后将悬液转移到另一个胶原包被的培养瓶中培养，称为PP2。
' }/ q/ y6 @# k8 l6、此后连续4d每隔24h将悬液离心、重悬后转移至新的培养瓶中，分别为PP3-PP6。
5 \  s5 C! E2 G6 Q( ~' f7、PP1-PP5弃去不用，PP6用于进一步诱导分化实验，细胞在达到约30％汇合时必须传代，继续接种至胶原预包被的新培养瓶内加入增殖培养基进行培养。5 W1 j6 W$ N4 k! @: U* d( L
8、PP6在汇合度达到30%前进行细胞表型鉴定，分别采用FCM检测desmin、CD45、bcl-2的阳性细胞数百分率。  L. f2 x! z1 E& A
9、采用免疫细胞化学检测desmin的表达情况。" ?- V0 c: c. Z# t
二、诱导分化实验：/ `( S3 b7 m/ y: W' R. B2 p- c* f
取PP6进行诱导，采用两种方法：
# w$ [7 O. y% W  j1 h4 V! v) G
  D* _) z; S. L, s8 ]! U! K1、共培养诱导：
/ ~$ W) k0 z: a' X! c4 Q细胞消化后离心去上清，用浓度为5mg/L的Hoechst33342（用增殖培养基配制）重悬，避光并在细胞培养箱内孵育20min，随后离心去上清，用增殖培养基重悬，调整密度至1x10~3个/ml，接种到6孔板，每个孔内加入等量的兔阴茎海绵体平滑肌细胞CCSMC进行共培养，2d后进行免疫组化检测α－SMA表达情况。. G% j# y; x( U, ^  w
另设一组对称的未处理组，即PP6单独培养组，以及CCSMC组作为阳性对照，进行激光共聚焦显微镜观察及拍照。# G; L- N+ r8 F% @3 N* B8 y4 A
2、直接诱导：
- |2 k3 f6 n, A: D+ A细胞消化下来后接种到6孔板，并且添加VEGF，使其在每孔的终浓度为25ug/L，置入培养箱，2d后进行免疫细胞化学以及Western blot法检测α－SMA表达情况（选用GAPDH作为内参）。$ d" y# v, n4 a& [
同时另设一对称的未处理组，即未添加VEGF的PP6单独培养，并设立成纤维细胞组作为阴性对照，以及CCSMC组作为阳性对照。9 U; F$ ?% {3 B8 a
! }' O% D4 k0 W
增殖培养基：20％的胎牛血清、20％马血清、80％DMED-LG% {# h( p: V3 X' i% d
6 A$ q% P* s# P% F
" U1 K3 @4 }" t% \  \* V0 |
Qu Z,Balkir L,Van Deutekom JC,et al. Development of approaches to improve cell survival in myoblast transfer therapy.J Cell Biol.1998,142:1257-1267

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CD34+CD38-的干细胞向 粒系的诱导分化:
, D+ e4 X8 y2 J* v( [细胞培养体系为lml,200微升的胎牛血清,800微升的IMEM,SCF 10ng, IL-3 5ng,# g  R: M, H1 ]% R
GM-CSF 5ng, G-CSF 5000U,前面三个因子是peprotech公司的,后一细胞因子就是临床的瑞白.在诱导的第七天可见所有的细胞都表达CD33,在诱导的14天可见90%的细胞CD15明显表达!

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脐血造血干细胞诱导分化为巨核细胞: ~6 Z  V2 `0 R1 F6 M; H
x123u：脐血造血干细胞诱导分化为巨核细胞
+ e. j8 Z6 o- F- B' J7 _! S# u# I( X% ~
1．用含肝素抗凝的无菌干燥瓶收集，采血量为80-100 ml。! h& t6 M7 z- ?' X3 @! B

: P* ]9 x2 T6 C& m& {: j1 H$ `' _2．细胞因子：TPO、FLT3-L 、IL-3、IL-6和SCF。: N" H0 `4 g" {7 N- V* Z2 `3 t3 z
' ^  f7 o! W, @# h
3．应用免疫磁珠MACS方法分离脐血CD34＋细胞，然后取部分细胞进行流式细胞仪测定、鉴定和分离纯度。9 y( a$ x" D: j2 V2 _
! }. d# n" }; b0 ~2 q
4．诱导方案：CD41＋细胞的体外诱导扩增用含10％ FCS和5×10 mol/L二巯基乙醇的IMDM，将CD34＋细胞浓度调整为2×10/ml，加入24孔板，每孔终体积为1mL。细胞因子组合为：TPO+SCF+ IL3+IL6，细胞因子的终浓度为：IL3 10 ng/ml，IL-6 10 ng/ml，SCF 50 ng/ml，TPO 10 ng/ml，FLT-3L 10 ng/ml。将上述扩增体系置37度饱和湿度CO2培养箱中培养，每3天半量换液1次，添加全量的造血生长因子，培养3周，在培养的第7天或14天测定培养体系的总细胞数，用流式细胞仪测定 CD41＋细胞的含量即为巨核细胞。
( a! O- a& G2 B1 J2 Q/ @
$ l/ G. f' u1 N) j" G5．甲基纤维素半固体培养法培养对CD41＋细胞进行集落培养以进一步鉴定。: Z: v& v" r& V5 s9 K9 k; Y
8 x& X  F' Y# W& H
参考文献：+ \7 u7 v* f( |/ }, _
1.Williams JL．Pipia GG ，Datta NS，et al. Thrombopoietin rquires additional mgakaryocyte-active cytokines for optimal，ex vivo expansion of megakaryocyte precursor cyells．Blood，1998；91：4118-4l26.6 X/ P* C; O/ Z3 n! I
2.Li K．Yan g M，Lam AC，et al. Efects offit3 ligan d in combination with TPO on the expan sion of megakaryocytic progenitors．Cell Transplant，2000；9：125-131.

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zeronepl
4 |3 }7 p/ ~3 h' u( B( W1.1 BMSCs向成骨细胞诱导分化6 r! l" X2 Q" K
诱导剂主要有10-8mol/L地塞米松、50μg/ml抗坏血酸、10mmol/L β-甘油磷酸钠、FBS和DMEM-LG液。; z4 ]% l! ]4 X- i* I9 T1 C
1.2 BMSCs向软骨细胞诱导分化
9 F2 O/ D# G; b2 H) |8 \/ i; H) }诱导剂主要有胰岛素、转铁蛋白、牛血清白蛋白、丙酮酸钠、亚油酸、维生素C、地塞米松、TGF-β。
4 @- d$ q6 J1 P) N( C2 z1.3 BMSCs向脂肪细胞诱导分化7 r- K% d5 B8 W1 |. e/ \. O
诱导剂主要有1-甲基-3-异丁基黄嘌呤、胰岛素、地塞米松和消炎痛等。6 r# U( F( M* v3 |4 ^% \% \
1.4 BMSCs向神经细胞诱导分化3 _$ W; Q& j5 p; H% u/ y& }
诱导剂主要有β-巯基乙醇、二甲基亚砜、丁化羟基苯甲醚。
3 P% s& w: D' B0 i; g, }( u$ w1.5 BMSCs向内皮细胞诱导分化
1 p  O  C! D; H# s7 _" o诱导剂主要有胰岛素、转铁蛋白、硒、牛血清白蛋白、地塞米松、2-磷酸抗坏血酸及微量VEGF等。
9 F' p4 @" r& k) W" }" t1.6 BMSCs向肝细胞诱导分化& J. j; {$ _- Q2 _+ s
1.7 BMSCs向心肌细胞诱导分化$ X4 O/ K1 ?8 v, S- x, u( [  Y* {
诱导剂主要有5-氮胞苷。3 l6 b$ q2 Z4 M" T0 D
1.8 BMSCs向胰岛细胞诱导分化
8 P* W  M- A  G& A诱导剂主要有β-巯基乙醇、尼克酰胺、B27。