MSC诱导分化专题

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样本:
* t' Z! T5 m2 J. F# I6 b5 p( uMSC向成骨细胞的诱导分化
- s0 m( R* N% m6 W1 h! J* s(1)取P2代MSC在传代的同时以2×104/cm2的密度接种于24孔板中，每孔加入15%FBS，1ng/ml bFGF的低糖DMEM培养液0.8ml；
% H& X' p6 H7 d. z(2)待细胞达80%融合，换为诱导培养液(高糖DMEM, 地塞米松 10-8M, β-磷酸甘油1.5mg/ml,抗坏血酸50μg/ml)，以后每3～4d换一次液；
: ^# ~$ A/ A3 }, e# h; b(3)2w后进行茜素S染色鉴定。
) a7 e+ X+ ~; U+ Q3 B5 y9 Q! F$ I; G# C6 \3.2.3 MSC向脂肪细胞的诱导分化
3 P# |0 |4 z4 K; t(1)取P2代MSC在传代的同时以2×104/cm2的密度接种于24孔板中，每孔加入15%FBS，1ng/ml bFGF的低糖DMEM培养液0.8ml；
3 @$ j/ c: @4 p3 c; v+ b# ^(2)待细胞达80%融合，换为诱导培养液(高糖DMEM, FBS 15%, 胰岛素 10ng/ul)，以后每3～4d换一次液；' B+ N7 I& R) r1 ^; F
(3)2w后进行苏丹Ⅳ染色鉴定。
, C& d) Q) N$ M; y6 Q; j+ b) |2 \MSC的成骨和成脂肪的检测; z  D4 N. i* N% G' t" q
茜素S染色方法, D; P% I2 p; m3 z+ Q9 b2 A* e0 t% F
(1)吸去培养液，PBS洗2次，每次5min;6 E" z4 K' F  S1 B7 A8 q
(2)90%乙醇固定15min，蒸馏水洗2次；
& {8 a( I) H. ?5 I& ]4 z; t(3)茜素S染色8min，蒸馏水洗2次,70%、95%及100%的乙醇分别固定5min,甘油封片。) _# O6 U% ~1 x" j  \$ w
苏丹Ⅳ染色方法
4 N+ L2 g" F6 w/ d(1)吸去培养液后用PBS洗2次，每次5min；3 F  l. L- J6 R$ Q, }/ ~* R
(2)10%甲醛固定15min，蒸馏水洗2次；( I+ `  i) H1 o& d) e3 b1 s: O6 {
(3)苏丹Ⅳ染色8min，蒸馏水洗2次,苏木精染色10min，自来水洗。甘油封片。

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成软骨细胞的诱导
; G0 r- \1 ~% \选前 三 代 生长良好的MSCs，消化后制成单细胞悬液，以3X 1 0"/ml的密度接
7 U( q5 }/ M& |4 r: L, X' C( n" `种于 细胞瓶中，待细胞达到80-90%融合后，每隔三天换液一次，倒置显微镜下观察 。14 天后 终止诱导。提取总RNA，设计II型前胶元的引物序列，COL(I I) 上游:5 ' -TTC AGC TAT GGA GAT GAC AAT C-3‘，下游:5’-AGA GTC CTA GAG TGA CTGAG-3 ，产物片断4756p，进行RT-PCR扩增。其产物经琼脂糖凝胶电泳后观察，检测II型前胶元mRNA的表达。
4 `% S: j! f  [$ K软骨细胞诱导液:
( ?% X. `; G' gDEM E 高糖 培养液，10%胎牛血清，100u/ml青霉素，l00g/ml链霉素，TGF/ M( B5 R' h+ p: H2 c) ~2 Y  W
-P }10ng/ml，抗坏血酸50ug/mla

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体外诱导MSCs向神经细胞分化( A9 K+ G! I! G+ H2 y. O: j: b
体外诱导MSCs向神经细胞分化5 g/ P7 Y9 G( L. y4 a, m
取体 外扩增至第2代的MScs，以lx105/ml浓度接种于放置有消毒盖玻片* H9 i7 S' J7 F; o
的6孔板内，制备细胞爬片。lw后进行诱导:加10ng/1lllEGF+含10%FBs
1 p/ s& L/ v  J' z5 E; X5 |的培养液预诱导3d，加lm oFLBME+含10%FBS的培养液预诱导ld，24h
% Z0 w% V3 L" v% x后加1林mo比声JRA+含10%FBs的培养液进行诱导。诱导24h后密切观察，可见多数细胞形成明显的神经元样细胞形态，胞体呈圆形，突起较长，双极或多极形，在突起末端出现分支，部分相邻细胞的突起连接成网。

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选择合适的代数（P3-5代）进行多向诱导分化
  Y! l# P1 y4 v成骨诱导培养液的配置：含10%FBS的α-MEM培养液中添加50 μM 抗坏血酸, 10mmβ-磷酸甘油 和 100nm 地塞米松；取P4细胞，按照5×103个/cm2接种6孔板，在生长培养液（α-MEM培养液）中长到基本融合时，更换成成骨诱导培养液，每3d换液，于 7d时进行碱性磷酸酶染色，28d时进行矿化结节的茜素红染色。
7 g$ z" e$ j8 m* R茜素红染色：吸去培养液，PBS冲洗两遍；10%甲醛实温固定15min； ddH2O冲洗两遍； 加入1ml/孔的40mM的茜素红染色液，室温孵育 20min并轻微振荡；吸取未结合的燃料，用ddH2O漂洗并振荡5min重复4次；倾斜放置2min,吸取多余的ddH2O；倒置显微镜观察拍照记录。( v, R% s9 |# d  ~$ J9 L7 ?
8 o9 T0 n$ n" ?* J; c, V7 c
成脂诱导培养液的配置：含10%FBS的HG-DMEM培养液中添加1μM地塞米松,10μg/ml胰岛素，200μM吲哚美辛和0.5mM IBMX；取P4细胞，按照2×104个/cm2接种6孔板，在生长培养液（HG-DMEM培养液）中长到基本融合时，更换成脂诱导培养液诱导2d,再用只含有10μg/ml胰岛素的成脂维持液培养1d，如此循环培养至14天，进行油红O染色。8 t8 {9 K' u! m6 X4 a7 z2 I! J
油红O染色：吸去培养液，PBS冲洗两遍；27.5%甲醛室温固定20min；ddH2O冲洗三遍，空气干燥；加入0.5%的油红O,室温孵育1h；70%乙醇洗涤3次；倒置显微镜观察拍照记录。

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肝样细胞诱导分化[1~3]
4 @5 k8 a9 j1 |$ `# EDMEM中补充bFGF\HGF分别至20ng/ml和10ng/ml，3天换液一次，重新补充因子，在7天左右可以检测得到肝特异基因，蛋白AFP，ALB等的表达
! m& E4 ?9 t  v; M4 g: I( g; i* |  H6 h" E/ n
1.Shin-Yeu Onga, Hui Daia, Kam W. Leonga,b, Inducing hepatic differentiation of human mesenchymal stem cells in pellet culture. Biomaterials. 2006, 4087–4097
/ {4 p  {3 }8 ^6 y8 b2. Taléns-Visconti a, A. Bonora a, R. Jover a, V. Mirabet b, F. Carbonell b.
$ o' y$ o# L+ G9 _# v* r0 v- ]  wHuman mesenchymal stem cells from adipose tissue: DiVerentiation: L, w$ X, o3 ?
into hepatic lineage .oxicology in Vitro 21 (2007) 324–329: @' s# m4 h# L+ {. ?5 j1 o0 b
3.Qing-Jun Zhoua, Yan-Dan Huanga,1, Li-Xin Xiang. In vitro differentiation of embryonic stem cells into hepatocytes induced by fibroblast growth factors. the International Journal of Biochemistry & Cell Biology ,2007,1714–1721

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2.rMSCs成骨和脂肪细胞诱导分化9 H4 t" t! O; c* F8 a0 P& F/ ]3 L& l
2.1体外定向诱导rMSCs分化为成骨细胞# b  F5 t; y" t+ T* ~/ I8 j
以接种密度为4×103/cm2将P3代rMSCs接种于预先置有盖玻片的6孔板内以制备细胞爬片。待细胞融合达80%,吸去孔内培养液,实验组每孔加入成骨条件培养基2mL置培养箱中,隔天换液1次，共诱导3周。对照组加入含10%胎牛血清(FCS)的L-DMEM培养液。3周末应用茜素红S染色法检测钙沉积。. Y9 _5 e4 ~7 H5 S+ h- K: Y& p0 @
茜素红S染色法步骤：
, R1 B8 Q! z. X. ?(1)诱导第21天,吸去成骨条件培养基,PBS洗涤3次
& L' B, a3 n( I& q6 L2 H  M! Q2 h(2)茜素红染2min。  t3 {1 G' D" K- F4 ~: B
(3)蒸馏水洗5-10s。
; F: ?5 s$ n# t3 I8 K(4)分化液洗15s。
) p( F2 d+ g" ~7 c* V- p6 i0 u, w(5)PBS洗涤3次，显微镜下观察并拍照。; Q1 a6 B0 n1 X8 J
2.2体外定向诱导rMSCs分化为脂肪细胞
  Q/ B% Q( f) [以4 ×103/cm2将P3代rMSCs密度接种于预先置有盖玻片的6孔板内以制备细胞爬片。细胞达到80％融合后,加入成脂条件培养基2 mL置培养箱中,隔天换液1次，共诱导3周。对照组加入含10%胎牛血清(FCS)的L-DMEM培养液。3周末应用油红O染色法检测脂滴形成
5 M1 B! z/ v1 z8 [7 o6 T油红O染色法步骤：1 T, A: D" [4 x. I
(1)细胞爬片用PBS清洗两次，每次5min;
( Z, U7 r5 X* T/ [+ ~. K% J(2)4%多聚甲醛固定15 min;
; u1 O9 @; d- v- A4 I# X(3)PBS漂洗两次，每次5min;" Y; {3 J: d' p! Y: E
(4)入60%异丙醇漂洗。3 X: h  B1 j5 q8 N* \
(5)入油红O染色15分钟。9 s2 m+ y( A$ [' ]) p) @
Devil60%异丙醇漂洗。; j0 u" A; Q- `6 E8 F

# V0 V4 |, F: b! u3.rMSCs成肌细胞诱导分化, n& W/ ^/ M" V' y" W; ?7 d8 f
以4 ×103/cm2将P3代rMSCs密度接种于预先置有盖玻片的6孔板内以制备细胞爬片。细胞达到80％融合后,加入含五氮杂胞苷（10umol/L，用 PBS配制）的DMEM2 mL置培养箱培养24小时,然后换用含有2%马血清的DMEM培养基培养7——10天。对照组换用PBS诱导24小时后，加入含2%马血清的L-DMEM 培养液。鉴定：可用MHC,MYOD,MYOGENIN,MHC等肌性标记物行免疫荧光染色。
( x8 i) E& U: O$ F参考文献：1.Wakitani, S., T. Saito, and A.I. Caplan, Myogenic cells derived from rat bone marrow mesenchymal stem cells exposed to 5-azacytidine. Muscle Nerve, 1995. 18(12): p. 1417-26.

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新西兰大白兔的肌源性干细胞MDSC诱导分化平滑肌细胞SMC
2 j3 C/ o. y  i: T7 h# H$ i& b* U一、利用差速贴壁法分离兔MDSC及鉴定：
. F! o) ?# B* c& x) a: q1、根据Qu～1方法改进：麻醉1.5个月龄2.0kg新西兰兔，无菌切取10g大腿肌肉，剪成肉泥并置入15ml无菌离心管中。+ B1 Q$ P$ i# Z4 n6 u( R8 e, C
2、分别用0.2％的ⅩⅠ型胶原酶消化1h、dispase消化45min以及0.1%trypsin消化30min。9 i, V: B; U  U2 X0 `/ ]; C% F+ a4 h
3、消化均在37℃恒温培养箱内进行，每次消化指间需离心并取沉淀进行下一步消化。; i0 o7 g* D% k; |
4、消化后的沉淀用增殖培养基重悬，并接种在用胶原（0.1％鼠尾胶溶液，自制）包被的培养瓶中，该瓶称为PP1。
  Z3 C2 h- W9 R7 C" z8 P5、PP1于37℃、5％CO2的细胞培养箱中静置过夜，随后将悬液转移到另一个胶原包被的培养瓶中培养，称为PP2。/ L; J6 S  S( J* F% f0 s1 \' _" y2 d
6、此后连续4d每隔24h将悬液离心、重悬后转移至新的培养瓶中，分别为PP3-PP6。
$ k9 @7 u# `3 A: o7、PP1-PP5弃去不用，PP6用于进一步诱导分化实验，细胞在达到约30％汇合时必须传代，继续接种至胶原预包被的新培养瓶内加入增殖培养基进行培养。
$ w& o" e) j: K6 e+ [& o% C8、PP6在汇合度达到30%前进行细胞表型鉴定，分别采用FCM检测desmin、CD45、bcl-2的阳性细胞数百分率。* y2 u# x4 x9 o. Q. [5 v
9、采用免疫细胞化学检测desmin的表达情况。
0 y* j% S& I( j  v( H: e7 H二、诱导分化实验：
7 ^8 ?2 F6 s+ F' y/ N6 n取PP6进行诱导，采用两种方法：
+ U9 r# {8 m- j2 O4 N1 w' W3 w
0 B! R1 u) Q$ ~. F1、共培养诱导：/ y! e5 O6 c  ]
细胞消化后离心去上清，用浓度为5mg/L的Hoechst33342（用增殖培养基配制）重悬，避光并在细胞培养箱内孵育20min，随后离心去上清，用增殖培养基重悬，调整密度至1x10~3个/ml，接种到6孔板，每个孔内加入等量的兔阴茎海绵体平滑肌细胞CCSMC进行共培养，2d后进行免疫组化检测α－SMA表达情况。
. P9 x6 U6 o' L4 V9 d另设一组对称的未处理组，即PP6单独培养组，以及CCSMC组作为阳性对照，进行激光共聚焦显微镜观察及拍照。
( p- o# R0 n0 m2、直接诱导：; P1 G0 [& V, U
细胞消化下来后接种到6孔板，并且添加VEGF，使其在每孔的终浓度为25ug/L，置入培养箱，2d后进行免疫细胞化学以及Western blot法检测α－SMA表达情况（选用GAPDH作为内参）。" O. ~( x3 Y: E: y6 K
同时另设一对称的未处理组，即未添加VEGF的PP6单独培养，并设立成纤维细胞组作为阴性对照，以及CCSMC组作为阳性对照。
" G; A9 I( B* _' q- u) z3 n$ J4 h- P4 X8 i$ I4 z
增殖培养基：20％的胎牛血清、20％马血清、80％DMED-LG
* O0 Z8 j# F- ~+ L2 f5 S1 W- q! _3 B5 D, u# m

6 E; P* b; q1 @5 ?$ \8 m. QQu Z,Balkir L,Van Deutekom JC,et al. Development of approaches to improve cell survival in myoblast transfer therapy.J Cell Biol.1998,142:1257-1267

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CD34+CD38-的干细胞向 粒系的诱导分化:7 F; q& F8 q/ D3 n
细胞培养体系为lml,200微升的胎牛血清,800微升的IMEM,SCF 10ng, IL-3 5ng,) K' p; u$ \1 S2 Y* k
GM-CSF 5ng, G-CSF 5000U,前面三个因子是peprotech公司的,后一细胞因子就是临床的瑞白.在诱导的第七天可见所有的细胞都表达CD33,在诱导的14天可见90%的细胞CD15明显表达!

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脐血造血干细胞诱导分化为巨核细胞
, k2 F# l1 c! W! `6 B1 t8 ax123u：脐血造血干细胞诱导分化为巨核细胞
9 A: w2 n( _7 I
+ }, D1 D" q% c' m1．用含肝素抗凝的无菌干燥瓶收集，采血量为80-100 ml。
7 ?0 F* J2 C/ b
* {( a+ f7 e' K% P0 e) ~$ T9 {2．细胞因子：TPO、FLT3-L 、IL-3、IL-6和SCF。1 l$ J# X5 t. i( {- E2 G

5 y( m  N; j' F! f, w+ Z3．应用免疫磁珠MACS方法分离脐血CD34＋细胞，然后取部分细胞进行流式细胞仪测定、鉴定和分离纯度。
. o$ l5 ~1 M  x$ U' `
8 O3 o( @7 O1 _) A5 B4．诱导方案：CD41＋细胞的体外诱导扩增用含10％ FCS和5×10 mol/L二巯基乙醇的IMDM，将CD34＋细胞浓度调整为2×10/ml，加入24孔板，每孔终体积为1mL。细胞因子组合为：TPO+SCF+ IL3+IL6，细胞因子的终浓度为：IL3 10 ng/ml，IL-6 10 ng/ml，SCF 50 ng/ml，TPO 10 ng/ml，FLT-3L 10 ng/ml。将上述扩增体系置37度饱和湿度CO2培养箱中培养，每3天半量换液1次，添加全量的造血生长因子，培养3周，在培养的第7天或14天测定培养体系的总细胞数，用流式细胞仪测定 CD41＋细胞的含量即为巨核细胞。
* h. w" ^1 z+ Y" u0 C
' b1 \, k  y7 Y# p% L" @. {5．甲基纤维素半固体培养法培养对CD41＋细胞进行集落培养以进一步鉴定。
6 p8 k1 h9 O( Y/ Z8 n1 S- v% w& @( @" e" U& }0 w9 Q. B
参考文献：
4 p2 f) \9 ?, [5 b# M1.Williams JL．Pipia GG ，Datta NS，et al. Thrombopoietin rquires additional mgakaryocyte-active cytokines for optimal，ex vivo expansion of megakaryocyte precursor cyells．Blood，1998；91：4118-4l26.
+ r1 N+ Q! J' |2.Li K．Yan g M，Lam AC，et al. Efects offit3 ligan d in combination with TPO on the expan sion of megakaryocytic progenitors．Cell Transplant，2000；9：125-131.

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zeronepl7 R) ?4 u* a. H! q+ l9 F5 x0 j" x
1.1 BMSCs向成骨细胞诱导分化9 j  A3 h) R# C7 X/ l
诱导剂主要有10-8mol/L地塞米松、50μg/ml抗坏血酸、10mmol/L β-甘油磷酸钠、FBS和DMEM-LG液。  P8 {# E: [+ W1 q) }# t5 x
1.2 BMSCs向软骨细胞诱导分化* q2 R1 |0 O: E( P3 K0 \
诱导剂主要有胰岛素、转铁蛋白、牛血清白蛋白、丙酮酸钠、亚油酸、维生素C、地塞米松、TGF-β。4 i& a; w1 K# n+ f: ^: o4 e
1.3 BMSCs向脂肪细胞诱导分化9 m0 y5 e5 m1 e& o5 K, t: A
诱导剂主要有1-甲基-3-异丁基黄嘌呤、胰岛素、地塞米松和消炎痛等。# ?1 @# v8 e/ C
1.4 BMSCs向神经细胞诱导分化
7 a7 V; ?+ j9 p6 K: M0 Q2 j诱导剂主要有β-巯基乙醇、二甲基亚砜、丁化羟基苯甲醚。7 ~* F2 P" U! D
1.5 BMSCs向内皮细胞诱导分化
; m4 U2 g# L2 P诱导剂主要有胰岛素、转铁蛋白、硒、牛血清白蛋白、地塞米松、2-磷酸抗坏血酸及微量VEGF等。; i- r/ q# T8 A; M
1.6 BMSCs向肝细胞诱导分化
8 q7 p" F& ]( D/ U1.7 BMSCs向心肌细胞诱导分化& I: Y) G7 W- r/ s  y' u9 k* g# L
诱导剂主要有5-氮胞苷。6 M9 K" N; @) G3 D3 M6 V# p( d
1.8 BMSCs向胰岛细胞诱导分化
8 }$ H# ~  `1 `3 B1 `9 c诱导剂主要有β-巯基乙醇、尼克酰胺、B27。