MSC诱导分化专题

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样本:
0 z; V1 I+ w" b8 `4 `7 H  IMSC向成骨细胞的诱导分化# f9 }, K8 y! e. i9 N( R( ^6 C
(1)取P2代MSC在传代的同时以2×104/cm2的密度接种于24孔板中，每孔加入15%FBS，1ng/ml bFGF的低糖DMEM培养液0.8ml；
2 T* ?4 M* g6 D5 l(2)待细胞达80%融合，换为诱导培养液(高糖DMEM, 地塞米松 10-8M, β-磷酸甘油1.5mg/ml,抗坏血酸50μg/ml)，以后每3～4d换一次液；
: O4 \. S8 J% H$ o: f(3)2w后进行茜素S染色鉴定。1 [$ Y: g" E! @' Q/ P/ O' O
3.2.3 MSC向脂肪细胞的诱导分化3 l% O  _4 l5 C9 x2 _+ g
(1)取P2代MSC在传代的同时以2×104/cm2的密度接种于24孔板中，每孔加入15%FBS，1ng/ml bFGF的低糖DMEM培养液0.8ml；* d. V% e4 V5 T6 E  T* G
(2)待细胞达80%融合，换为诱导培养液(高糖DMEM, FBS 15%, 胰岛素 10ng/ul)，以后每3～4d换一次液；4 a, Q+ r/ q+ f& {2 L3 X
(3)2w后进行苏丹Ⅳ染色鉴定。' u  _, p0 b% T" [% Y, f# ?7 _
MSC的成骨和成脂肪的检测
" D; M6 F. x/ [茜素S染色方法
, x: `  W5 C' M, j2 K. g4 W(1)吸去培养液，PBS洗2次，每次5min;8 g9 L" c4 S, w- f0 N- N) i  H
(2)90%乙醇固定15min，蒸馏水洗2次；  o) F- B( w5 k/ A( W
(3)茜素S染色8min，蒸馏水洗2次,70%、95%及100%的乙醇分别固定5min,甘油封片。
9 A* _' J8 V9 }苏丹Ⅳ染色方法, i. R4 _8 y5 N, U
(1)吸去培养液后用PBS洗2次，每次5min；
+ g6 @- W, r& ^6 t% _0 Q9 B(2)10%甲醛固定15min，蒸馏水洗2次；
7 B* D6 i/ M6 U: X$ V, O(3)苏丹Ⅳ染色8min，蒸馏水洗2次,苏木精染色10min，自来水洗。甘油封片。

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成软骨细胞的诱导
" B! H- I+ @+ Z2 d' W. i) _选前 三 代 生长良好的MSCs，消化后制成单细胞悬液，以3X 1 0"/ml的密度接& m' K, q# l5 }' ^" l- U$ Q
种于 细胞瓶中，待细胞达到80-90%融合后，每隔三天换液一次，倒置显微镜下观察 。14 天后 终止诱导。提取总RNA，设计II型前胶元的引物序列，COL(I I) 上游:5 ' -TTC AGC TAT GGA GAT GAC AAT C-3‘，下游:5’-AGA GTC CTA GAG TGA CTGAG-3 ，产物片断4756p，进行RT-PCR扩增。其产物经琼脂糖凝胶电泳后观察，检测II型前胶元mRNA的表达。* x, ^0 w3 g$ P5 L6 D% z2 [8 N  f
软骨细胞诱导液:* Z0 U1 N& y$ O* Y1 j- m/ t+ z
DEM E 高糖 培养液，10%胎牛血清，100u/ml青霉素，l00g/ml链霉素，TGF
" B5 q0 f7 H- `, B! s-P }10ng/ml，抗坏血酸50ug/mla

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体外诱导MSCs向神经细胞分化  `2 v7 ~( q) K% B3 q& Y$ \+ R
体外诱导MSCs向神经细胞分化$ h$ m1 }' ?+ z3 |! a0 t' R* i; M
取体 外扩增至第2代的MScs，以lx105/ml浓度接种于放置有消毒盖玻片
: D% k2 q* H) ^, y的6孔板内，制备细胞爬片。lw后进行诱导:加10ng/1lllEGF+含10%FBs9 z% }* x0 _- c$ U- v; r6 a1 O
的培养液预诱导3d，加lm oFLBME+含10%FBS的培养液预诱导ld，24h
* S: A. ?5 F% u0 z8 e后加1林mo比声JRA+含10%FBs的培养液进行诱导。诱导24h后密切观察，可见多数细胞形成明显的神经元样细胞形态，胞体呈圆形，突起较长，双极或多极形，在突起末端出现分支，部分相邻细胞的突起连接成网。

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选择合适的代数（P3-5代）进行多向诱导分化
1 e2 G0 Z! _3 z6 K- X, i) u成骨诱导培养液的配置：含10%FBS的α-MEM培养液中添加50 μM 抗坏血酸, 10mmβ-磷酸甘油 和 100nm 地塞米松；取P4细胞，按照5×103个/cm2接种6孔板，在生长培养液（α-MEM培养液）中长到基本融合时，更换成成骨诱导培养液，每3d换液，于 7d时进行碱性磷酸酶染色，28d时进行矿化结节的茜素红染色。
7 ]9 S" |! {9 V8 v+ O茜素红染色：吸去培养液，PBS冲洗两遍；10%甲醛实温固定15min； ddH2O冲洗两遍； 加入1ml/孔的40mM的茜素红染色液，室温孵育 20min并轻微振荡；吸取未结合的燃料，用ddH2O漂洗并振荡5min重复4次；倾斜放置2min,吸取多余的ddH2O；倒置显微镜观察拍照记录。9 S0 v1 s; R* m2 h& \
/ {' i6 n5 b. D) e$ p. v
成脂诱导培养液的配置：含10%FBS的HG-DMEM培养液中添加1μM地塞米松,10μg/ml胰岛素，200μM吲哚美辛和0.5mM IBMX；取P4细胞，按照2×104个/cm2接种6孔板，在生长培养液（HG-DMEM培养液）中长到基本融合时，更换成脂诱导培养液诱导2d,再用只含有10μg/ml胰岛素的成脂维持液培养1d，如此循环培养至14天，进行油红O染色。6 j1 S. N% i' ^1 z% Z
油红O染色：吸去培养液，PBS冲洗两遍；27.5%甲醛室温固定20min；ddH2O冲洗三遍，空气干燥；加入0.5%的油红O,室温孵育1h；70%乙醇洗涤3次；倒置显微镜观察拍照记录。

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肝样细胞诱导分化[1~3]
( ]8 V5 o' B4 l( i. E) d- `. mDMEM中补充bFGF\HGF分别至20ng/ml和10ng/ml，3天换液一次，重新补充因子，在7天左右可以检测得到肝特异基因，蛋白AFP，ALB等的表达
3 i0 W! Z; B8 A) h4 k4 r  ?* C' a
1.Shin-Yeu Onga, Hui Daia, Kam W. Leonga,b, Inducing hepatic differentiation of human mesenchymal stem cells in pellet culture. Biomaterials. 2006, 4087–4097+ _) c: b0 x' d! R# }
2. Taléns-Visconti a, A. Bonora a, R. Jover a, V. Mirabet b, F. Carbonell b.
6 {, P: H& u* T6 i$ lHuman mesenchymal stem cells from adipose tissue: DiVerentiation, ?" w0 p7 `; U# r2 @6 }
into hepatic lineage .oxicology in Vitro 21 (2007) 324–329
' W/ N/ I; q  j; h, m) E1 n3.Qing-Jun Zhoua, Yan-Dan Huanga,1, Li-Xin Xiang. In vitro differentiation of embryonic stem cells into hepatocytes induced by fibroblast growth factors. the International Journal of Biochemistry & Cell Biology ,2007,1714–1721

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2.rMSCs成骨和脂肪细胞诱导分化
$ D/ N! _  k4 M# h) j+ H$ C2.1体外定向诱导rMSCs分化为成骨细胞
' C" w) h! z; E* L: K; j. I4 W以接种密度为4×103/cm2将P3代rMSCs接种于预先置有盖玻片的6孔板内以制备细胞爬片。待细胞融合达80%,吸去孔内培养液,实验组每孔加入成骨条件培养基2mL置培养箱中,隔天换液1次，共诱导3周。对照组加入含10%胎牛血清(FCS)的L-DMEM培养液。3周末应用茜素红S染色法检测钙沉积。. A4 a$ H  B6 a+ B
茜素红S染色法步骤：& T* J1 @( N, G. V9 O- v7 N# X; `
(1)诱导第21天,吸去成骨条件培养基,PBS洗涤3次" q2 s9 a" b" Z# h, Y& ]% e7 I
(2)茜素红染2min。
9 J. G% {4 [& q) v(3)蒸馏水洗5-10s。
' w) U  c" y1 z& C) i(4)分化液洗15s。0 Y7 |/ i% t+ H
(5)PBS洗涤3次，显微镜下观察并拍照。% \5 ]& v2 n8 y% Q" _: a
2.2体外定向诱导rMSCs分化为脂肪细胞
' ]: _$ t8 x1 i) M6 ~以4 ×103/cm2将P3代rMSCs密度接种于预先置有盖玻片的6孔板内以制备细胞爬片。细胞达到80％融合后,加入成脂条件培养基2 mL置培养箱中,隔天换液1次，共诱导3周。对照组加入含10%胎牛血清(FCS)的L-DMEM培养液。3周末应用油红O染色法检测脂滴形成8 b$ L& F0 h# k" Q
油红O染色法步骤：5 X' |$ J& V/ W; V( b, o0 [
(1)细胞爬片用PBS清洗两次，每次5min;( [7 A+ z) r5 j) y1 F' U. n& \
(2)4%多聚甲醛固定15 min;6 ~% W8 l4 z, j7 I
(3)PBS漂洗两次，每次5min;
% @7 l" z* Z/ q; U, r+ |; l# [(4)入60%异丙醇漂洗。
4 H5 Q+ _; B- j(5)入油红O染色15分钟。# i( A2 I" Z1 z. J1 m
Devil60%异丙醇漂洗。* }: l; J7 a5 m
5 W' K, Q# T* A) a
3.rMSCs成肌细胞诱导分化
* G. Z/ \) ]" R9 H* E  A0 n以4 ×103/cm2将P3代rMSCs密度接种于预先置有盖玻片的6孔板内以制备细胞爬片。细胞达到80％融合后,加入含五氮杂胞苷（10umol/L，用 PBS配制）的DMEM2 mL置培养箱培养24小时,然后换用含有2%马血清的DMEM培养基培养7——10天。对照组换用PBS诱导24小时后，加入含2%马血清的L-DMEM 培养液。鉴定：可用MHC,MYOD,MYOGENIN,MHC等肌性标记物行免疫荧光染色。  B! {( y2 Y2 ], K9 L
参考文献：1.Wakitani, S., T. Saito, and A.I. Caplan, Myogenic cells derived from rat bone marrow mesenchymal stem cells exposed to 5-azacytidine. Muscle Nerve, 1995. 18(12): p. 1417-26.

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新西兰大白兔的肌源性干细胞MDSC诱导分化平滑肌细胞SMC! ^; m: G0 @8 P' y
一、利用差速贴壁法分离兔MDSC及鉴定：* X' Z& `: Q. y$ I# n. G# k! Z
1、根据Qu～1方法改进：麻醉1.5个月龄2.0kg新西兰兔，无菌切取10g大腿肌肉，剪成肉泥并置入15ml无菌离心管中。
4 Z2 A3 H2 ~& h! R2、分别用0.2％的ⅩⅠ型胶原酶消化1h、dispase消化45min以及0.1%trypsin消化30min。  H& W+ H1 T2 F3 h. {
3、消化均在37℃恒温培养箱内进行，每次消化指间需离心并取沉淀进行下一步消化。! _! N! |0 Q5 D  E# W! J
4、消化后的沉淀用增殖培养基重悬，并接种在用胶原（0.1％鼠尾胶溶液，自制）包被的培养瓶中，该瓶称为PP1。
8 t) C  {5 q5 b7 f, \+ O/ C, b: [5、PP1于37℃、5％CO2的细胞培养箱中静置过夜，随后将悬液转移到另一个胶原包被的培养瓶中培养，称为PP2。$ {6 G* U) f! W( k" \$ c
6、此后连续4d每隔24h将悬液离心、重悬后转移至新的培养瓶中，分别为PP3-PP6。
  H7 J: m4 V, Z  ?* J1 g7、PP1-PP5弃去不用，PP6用于进一步诱导分化实验，细胞在达到约30％汇合时必须传代，继续接种至胶原预包被的新培养瓶内加入增殖培养基进行培养。
6 k# S  ?0 V. \8、PP6在汇合度达到30%前进行细胞表型鉴定，分别采用FCM检测desmin、CD45、bcl-2的阳性细胞数百分率。
) Z4 E7 |3 e( k6 h% D9、采用免疫细胞化学检测desmin的表达情况。; X, ?* [+ B2 ^" B* {" q
二、诱导分化实验：7 v5 T7 @$ s2 ^3 c+ ^
取PP6进行诱导，采用两种方法：4 L3 e2 D/ b* K. D* b" H
2 I6 [4 g* C* \7 e: ]5 P
1、共培养诱导：" Z$ b1 k  h2 z8 p& r5 [' l
细胞消化后离心去上清，用浓度为5mg/L的Hoechst33342（用增殖培养基配制）重悬，避光并在细胞培养箱内孵育20min，随后离心去上清，用增殖培养基重悬，调整密度至1x10~3个/ml，接种到6孔板，每个孔内加入等量的兔阴茎海绵体平滑肌细胞CCSMC进行共培养，2d后进行免疫组化检测α－SMA表达情况。
5 i- Y8 J1 U# Q  l1 b/ C9 ^8 W: T另设一组对称的未处理组，即PP6单独培养组，以及CCSMC组作为阳性对照，进行激光共聚焦显微镜观察及拍照。! d; A* G7 C! B  h  n% p& k5 Q
2、直接诱导：! `- d2 B# h' x
细胞消化下来后接种到6孔板，并且添加VEGF，使其在每孔的终浓度为25ug/L，置入培养箱，2d后进行免疫细胞化学以及Western blot法检测α－SMA表达情况（选用GAPDH作为内参）。' _1 I% e$ [9 B1 a) \
同时另设一对称的未处理组，即未添加VEGF的PP6单独培养，并设立成纤维细胞组作为阴性对照，以及CCSMC组作为阳性对照。
5 d- G: k. o: Z/ l. b' c$ u% q
4 v* J) Y4 o6 q, a( A增殖培养基：20％的胎牛血清、20％马血清、80％DMED-LG
' H* ^  t- s8 L$ v$ O) V
* l! c2 Z+ Z( E6 ^2 p" ^; t# j: c7 o9 b
0 n2 ~7 C9 [; jQu Z,Balkir L,Van Deutekom JC,et al. Development of approaches to improve cell survival in myoblast transfer therapy.J Cell Biol.1998,142:1257-1267

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CD34+CD38-的干细胞向 粒系的诱导分化:
1 ]$ F! x! [# l细胞培养体系为lml,200微升的胎牛血清,800微升的IMEM,SCF 10ng, IL-3 5ng,
% ~8 n9 x1 Z: y6 u$ w4 u2 [GM-CSF 5ng, G-CSF 5000U,前面三个因子是peprotech公司的,后一细胞因子就是临床的瑞白.在诱导的第七天可见所有的细胞都表达CD33,在诱导的14天可见90%的细胞CD15明显表达!

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脐血造血干细胞诱导分化为巨核细胞
4 t( _9 n6 M/ \' }1 Nx123u：脐血造血干细胞诱导分化为巨核细胞/ D8 \. j( h% F" C

; V3 K/ y7 g2 V  L1．用含肝素抗凝的无菌干燥瓶收集，采血量为80-100 ml。9 l; f) c( q+ S
" k, g3 X# _  N
2．细胞因子：TPO、FLT3-L 、IL-3、IL-6和SCF。- Y8 w6 x/ ?: I9 i5 v
+ W) `! R# q; h
3．应用免疫磁珠MACS方法分离脐血CD34＋细胞，然后取部分细胞进行流式细胞仪测定、鉴定和分离纯度。
) i7 Y. a5 t8 I4 Z! N& x5 {
" }1 T/ q  p+ p2 P. T" r4．诱导方案：CD41＋细胞的体外诱导扩增用含10％ FCS和5×10 mol/L二巯基乙醇的IMDM，将CD34＋细胞浓度调整为2×10/ml，加入24孔板，每孔终体积为1mL。细胞因子组合为：TPO+SCF+ IL3+IL6，细胞因子的终浓度为：IL3 10 ng/ml，IL-6 10 ng/ml，SCF 50 ng/ml，TPO 10 ng/ml，FLT-3L 10 ng/ml。将上述扩增体系置37度饱和湿度CO2培养箱中培养，每3天半量换液1次，添加全量的造血生长因子，培养3周，在培养的第7天或14天测定培养体系的总细胞数，用流式细胞仪测定 CD41＋细胞的含量即为巨核细胞。
, C4 J3 K* B( ^; x/ D# `; K  k& Z' \! I- t3 C2 c  Z
5．甲基纤维素半固体培养法培养对CD41＋细胞进行集落培养以进一步鉴定。
) {# F; R3 m* B- X
/ m+ Y: x( T# D5 T1 T参考文献：+ X3 U; S* z; I0 \. u+ @) a: S
1.Williams JL．Pipia GG ，Datta NS，et al. Thrombopoietin rquires additional mgakaryocyte-active cytokines for optimal，ex vivo expansion of megakaryocyte precursor cyells．Blood，1998；91：4118-4l26.
2 h+ q, {/ l& W$ }# W2.Li K．Yan g M，Lam AC，et al. Efects offit3 ligan d in combination with TPO on the expan sion of megakaryocytic progenitors．Cell Transplant，2000；9：125-131.

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zeronepl
) P, d5 a' s! R2 p2 q1.1 BMSCs向成骨细胞诱导分化
6 K( s# A* y7 C0 \' ^9 k诱导剂主要有10-8mol/L地塞米松、50μg/ml抗坏血酸、10mmol/L β-甘油磷酸钠、FBS和DMEM-LG液。1 Z; d' F, a  F' A* _  r
1.2 BMSCs向软骨细胞诱导分化
  }' U. Z% x6 B8 T( h诱导剂主要有胰岛素、转铁蛋白、牛血清白蛋白、丙酮酸钠、亚油酸、维生素C、地塞米松、TGF-β。+ c3 T, d: J5 A2 ?: c6 a2 q- L
1.3 BMSCs向脂肪细胞诱导分化+ A* ^# T; c! ^! j6 m! L7 [
诱导剂主要有1-甲基-3-异丁基黄嘌呤、胰岛素、地塞米松和消炎痛等。
' M) ?+ ~; V0 [1.4 BMSCs向神经细胞诱导分化
, |4 R# w+ @  w& l/ F8 e3 N* E4 A1 H诱导剂主要有β-巯基乙醇、二甲基亚砜、丁化羟基苯甲醚。
- X# _# q6 I8 F& s: p$ G; f# C1 o1.5 BMSCs向内皮细胞诱导分化
) ?% W7 @5 z/ D; G3 _4 K1 V0 @诱导剂主要有胰岛素、转铁蛋白、硒、牛血清白蛋白、地塞米松、2-磷酸抗坏血酸及微量VEGF等。5 d, e& l' _$ k7 n9 Q
1.6 BMSCs向肝细胞诱导分化4 r5 E$ G* y7 u4 \
1.7 BMSCs向心肌细胞诱导分化
/ u2 x# k! D9 ]诱导剂主要有5-氮胞苷。9 D3 d9 u  A1 D
1.8 BMSCs向胰岛细胞诱导分化0 ~* Z5 j% `( I. {( q* X2 K
诱导剂主要有β-巯基乙醇、尼克酰胺、B27。