MSC诱导分化专题

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样本:/ q3 `0 o  G" b1 t7 C
MSC向成骨细胞的诱导分化
  q3 q1 [, \2 n7 }$ c(1)取P2代MSC在传代的同时以2×104/cm2的密度接种于24孔板中，每孔加入15%FBS，1ng/ml bFGF的低糖DMEM培养液0.8ml；
# E; E$ y) u" ]; @(2)待细胞达80%融合，换为诱导培养液(高糖DMEM, 地塞米松 10-8M, β-磷酸甘油1.5mg/ml,抗坏血酸50μg/ml)，以后每3～4d换一次液；) @# A, O( U9 S+ d# V- F: w
(3)2w后进行茜素S染色鉴定。
3 _' K7 ]: U/ n* C3.2.3 MSC向脂肪细胞的诱导分化
7 C5 ?6 `, O1 Y$ U/ M(1)取P2代MSC在传代的同时以2×104/cm2的密度接种于24孔板中，每孔加入15%FBS，1ng/ml bFGF的低糖DMEM培养液0.8ml；
* G. I! T! I4 p+ t: o% S5 i(2)待细胞达80%融合，换为诱导培养液(高糖DMEM, FBS 15%, 胰岛素 10ng/ul)，以后每3～4d换一次液；
0 ~* f$ f$ O& x9 T8 o$ V  n8 D(3)2w后进行苏丹Ⅳ染色鉴定。- E: @; m" H% g) m" l: o  o, w
MSC的成骨和成脂肪的检测
: e  Z  k/ K# _; B茜素S染色方法
& H7 t  j* ]: D4 t/ o5 N, K: Y(1)吸去培养液，PBS洗2次，每次5min;. `" m- _( _( w# I2 m
(2)90%乙醇固定15min，蒸馏水洗2次；5 Q) Y+ _' s0 E: X
(3)茜素S染色8min，蒸馏水洗2次,70%、95%及100%的乙醇分别固定5min,甘油封片。
0 F% s4 R3 u& k6 |/ }苏丹Ⅳ染色方法
$ a! {: a/ K' y; r(1)吸去培养液后用PBS洗2次，每次5min；
8 _- U% c" j  v) \. @( F- J9 r(2)10%甲醛固定15min，蒸馏水洗2次；0 J1 Y- ]8 m+ p) d# `
(3)苏丹Ⅳ染色8min，蒸馏水洗2次,苏木精染色10min，自来水洗。甘油封片。

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成软骨细胞的诱导
2 S4 C  v# D$ R9 X( \( d选前 三 代 生长良好的MSCs，消化后制成单细胞悬液，以3X 1 0"/ml的密度接
2 [( X- r3 F4 W' T种于 细胞瓶中，待细胞达到80-90%融合后，每隔三天换液一次，倒置显微镜下观察 。14 天后 终止诱导。提取总RNA，设计II型前胶元的引物序列，COL(I I) 上游:5 ' -TTC AGC TAT GGA GAT GAC AAT C-3‘，下游:5’-AGA GTC CTA GAG TGA CTGAG-3 ，产物片断4756p，进行RT-PCR扩增。其产物经琼脂糖凝胶电泳后观察，检测II型前胶元mRNA的表达。
# \- E1 f1 M. H8 J: |2 s8 I4 P5 v$ V/ a软骨细胞诱导液:  \& m( ?0 B9 [. p& N% M
DEM E 高糖 培养液，10%胎牛血清，100u/ml青霉素，l00g/ml链霉素，TGF
4 T4 V  ~) S; t* M( J( A+ Y-P }10ng/ml，抗坏血酸50ug/mla

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体外诱导MSCs向神经细胞分化, |* C) }; s8 R% ^
体外诱导MSCs向神经细胞分化1 a/ i' X2 K2 l  Q) ^& y- N! `% T" u
取体 外扩增至第2代的MScs，以lx105/ml浓度接种于放置有消毒盖玻片
& o6 d# u+ V, }的6孔板内，制备细胞爬片。lw后进行诱导:加10ng/1lllEGF+含10%FBs  p' h0 Y. N; K. _
的培养液预诱导3d，加lm oFLBME+含10%FBS的培养液预诱导ld，24h( t. J8 F" `$ \& H: S
后加1林mo比声JRA+含10%FBs的培养液进行诱导。诱导24h后密切观察，可见多数细胞形成明显的神经元样细胞形态，胞体呈圆形，突起较长，双极或多极形，在突起末端出现分支，部分相邻细胞的突起连接成网。

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选择合适的代数（P3-5代）进行多向诱导分化
6 ?! o7 x% u$ v/ |成骨诱导培养液的配置：含10%FBS的α-MEM培养液中添加50 μM 抗坏血酸, 10mmβ-磷酸甘油 和 100nm 地塞米松；取P4细胞，按照5×103个/cm2接种6孔板，在生长培养液（α-MEM培养液）中长到基本融合时，更换成成骨诱导培养液，每3d换液，于 7d时进行碱性磷酸酶染色，28d时进行矿化结节的茜素红染色。
1 x: t. u! P" g  A# h) Q! k茜素红染色：吸去培养液，PBS冲洗两遍；10%甲醛实温固定15min； ddH2O冲洗两遍； 加入1ml/孔的40mM的茜素红染色液，室温孵育 20min并轻微振荡；吸取未结合的燃料，用ddH2O漂洗并振荡5min重复4次；倾斜放置2min,吸取多余的ddH2O；倒置显微镜观察拍照记录。- R6 u" @3 v9 Q7 r

2 K! Q' ~3 b) @" l3 N成脂诱导培养液的配置：含10%FBS的HG-DMEM培养液中添加1μM地塞米松,10μg/ml胰岛素，200μM吲哚美辛和0.5mM IBMX；取P4细胞，按照2×104个/cm2接种6孔板，在生长培养液（HG-DMEM培养液）中长到基本融合时，更换成脂诱导培养液诱导2d,再用只含有10μg/ml胰岛素的成脂维持液培养1d，如此循环培养至14天，进行油红O染色。- }: D  M  v( U
油红O染色：吸去培养液，PBS冲洗两遍；27.5%甲醛室温固定20min；ddH2O冲洗三遍，空气干燥；加入0.5%的油红O,室温孵育1h；70%乙醇洗涤3次；倒置显微镜观察拍照记录。

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肝样细胞诱导分化[1~3]* n3 N- |' r7 R
DMEM中补充bFGF\HGF分别至20ng/ml和10ng/ml，3天换液一次，重新补充因子，在7天左右可以检测得到肝特异基因，蛋白AFP，ALB等的表达
3 d9 r' \! [6 @, I2 t% Z4 R  |" D; L" e. w* P& R( E7 V& K
1.Shin-Yeu Onga, Hui Daia, Kam W. Leonga,b, Inducing hepatic differentiation of human mesenchymal stem cells in pellet culture. Biomaterials. 2006, 4087–4097% Z: `& D% N0 C% {( d
2. Taléns-Visconti a, A. Bonora a, R. Jover a, V. Mirabet b, F. Carbonell b.! P/ d% d- a' m5 r4 c
Human mesenchymal stem cells from adipose tissue: DiVerentiation
- _$ T! U& Z3 A+ L# _6 vinto hepatic lineage .oxicology in Vitro 21 (2007) 324–329* }9 c% V* [; B6 ]
3.Qing-Jun Zhoua, Yan-Dan Huanga,1, Li-Xin Xiang. In vitro differentiation of embryonic stem cells into hepatocytes induced by fibroblast growth factors. the International Journal of Biochemistry & Cell Biology ,2007,1714–1721

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2.rMSCs成骨和脂肪细胞诱导分化
% n/ Q( B" `- b* e4 n9 _: S2 F2.1体外定向诱导rMSCs分化为成骨细胞
( g- T: D. Q. ^8 d/ p: B8 c以接种密度为4×103/cm2将P3代rMSCs接种于预先置有盖玻片的6孔板内以制备细胞爬片。待细胞融合达80%,吸去孔内培养液,实验组每孔加入成骨条件培养基2mL置培养箱中,隔天换液1次，共诱导3周。对照组加入含10%胎牛血清(FCS)的L-DMEM培养液。3周末应用茜素红S染色法检测钙沉积。# I- s$ K3 ], K
茜素红S染色法步骤：
9 N$ q; b# O2 u, p( b* R3 y9 _9 A+ `& x(1)诱导第21天,吸去成骨条件培养基,PBS洗涤3次
$ l2 P+ t' @* R; s+ u! h! z/ R(2)茜素红染2min。1 N: b, N" B- ?- s/ t1 k  I3 p
(3)蒸馏水洗5-10s。
6 R) x; {  N7 S(4)分化液洗15s。/ ^8 m8 G& V+ X) D1 }
(5)PBS洗涤3次，显微镜下观察并拍照。- {2 g$ a& A# S9 t
2.2体外定向诱导rMSCs分化为脂肪细胞
8 d# {4 ^% \( a0 |1 V以4 ×103/cm2将P3代rMSCs密度接种于预先置有盖玻片的6孔板内以制备细胞爬片。细胞达到80％融合后,加入成脂条件培养基2 mL置培养箱中,隔天换液1次，共诱导3周。对照组加入含10%胎牛血清(FCS)的L-DMEM培养液。3周末应用油红O染色法检测脂滴形成4 k  Q$ Y1 Z6 a! B; y0 u, Q
油红O染色法步骤：
! }9 H, a' n9 X* R8 i/ W4 W$ ^9 \(1)细胞爬片用PBS清洗两次，每次5min;
  l. |2 A  H/ }(2)4%多聚甲醛固定15 min;7 `& \. v% [! `! v0 f3 T# I
(3)PBS漂洗两次，每次5min;
5 K/ l8 w$ v7 b' I( K* Q  z, Y(4)入60%异丙醇漂洗。
* ?8 h& |4 t/ \0 f% ?) W(5)入油红O染色15分钟。
+ O* W7 R7 V. l( LDevil60%异丙醇漂洗。
# [' \! I# r5 ]: V4 C1 R( K; q  T9 i! ~. _- g8 h0 c
3.rMSCs成肌细胞诱导分化4 V3 j9 x8 `7 H/ @$ P3 t
以4 ×103/cm2将P3代rMSCs密度接种于预先置有盖玻片的6孔板内以制备细胞爬片。细胞达到80％融合后,加入含五氮杂胞苷（10umol/L，用 PBS配制）的DMEM2 mL置培养箱培养24小时,然后换用含有2%马血清的DMEM培养基培养7——10天。对照组换用PBS诱导24小时后，加入含2%马血清的L-DMEM 培养液。鉴定：可用MHC,MYOD,MYOGENIN,MHC等肌性标记物行免疫荧光染色。
6 E8 Z& i' _- V) h! S参考文献：1.Wakitani, S., T. Saito, and A.I. Caplan, Myogenic cells derived from rat bone marrow mesenchymal stem cells exposed to 5-azacytidine. Muscle Nerve, 1995. 18(12): p. 1417-26.

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新西兰大白兔的肌源性干细胞MDSC诱导分化平滑肌细胞SMC* m4 f# D. s$ h* V
一、利用差速贴壁法分离兔MDSC及鉴定：
6 G% S+ f) l; X0 ?% Y1、根据Qu～1方法改进：麻醉1.5个月龄2.0kg新西兰兔，无菌切取10g大腿肌肉，剪成肉泥并置入15ml无菌离心管中。; T, [2 J7 I, R
2、分别用0.2％的ⅩⅠ型胶原酶消化1h、dispase消化45min以及0.1%trypsin消化30min。1 A" ?  }9 G+ V' a
3、消化均在37℃恒温培养箱内进行，每次消化指间需离心并取沉淀进行下一步消化。
- ?5 b0 O0 z+ g  c/ A4、消化后的沉淀用增殖培养基重悬，并接种在用胶原（0.1％鼠尾胶溶液，自制）包被的培养瓶中，该瓶称为PP1。: r$ ^, F) y0 V1 }4 L# o$ E
5、PP1于37℃、5％CO2的细胞培养箱中静置过夜，随后将悬液转移到另一个胶原包被的培养瓶中培养，称为PP2。
; ~+ n0 j; m1 b% J0 t6、此后连续4d每隔24h将悬液离心、重悬后转移至新的培养瓶中，分别为PP3-PP6。
$ [* q7 `% ~" `7、PP1-PP5弃去不用，PP6用于进一步诱导分化实验，细胞在达到约30％汇合时必须传代，继续接种至胶原预包被的新培养瓶内加入增殖培养基进行培养。
( r1 S( {) ]" O8、PP6在汇合度达到30%前进行细胞表型鉴定，分别采用FCM检测desmin、CD45、bcl-2的阳性细胞数百分率。, G( D- P  F' {: D6 A9 }- W
9、采用免疫细胞化学检测desmin的表达情况。
" p# I) c; r0 g: z! B6 ?1 x6 s9 H二、诱导分化实验：
9 g2 ]+ h  Q2 _  k( F5 l9 ]取PP6进行诱导，采用两种方法：
; ~+ k' R6 b. L. H1 h
, L$ L- v( G+ a- H5 F( ~3 }1、共培养诱导：
+ D" \' g' y& O# V  I, U细胞消化后离心去上清，用浓度为5mg/L的Hoechst33342（用增殖培养基配制）重悬，避光并在细胞培养箱内孵育20min，随后离心去上清，用增殖培养基重悬，调整密度至1x10~3个/ml，接种到6孔板，每个孔内加入等量的兔阴茎海绵体平滑肌细胞CCSMC进行共培养，2d后进行免疫组化检测α－SMA表达情况。& R8 i& X1 E+ r
另设一组对称的未处理组，即PP6单独培养组，以及CCSMC组作为阳性对照，进行激光共聚焦显微镜观察及拍照。: T/ F* \9 J! F' g( X$ A" w3 \
2、直接诱导：: Q/ j0 g: y- M# @  A) j
细胞消化下来后接种到6孔板，并且添加VEGF，使其在每孔的终浓度为25ug/L，置入培养箱，2d后进行免疫细胞化学以及Western blot法检测α－SMA表达情况（选用GAPDH作为内参）。
: t0 \+ |7 ?! D& S同时另设一对称的未处理组，即未添加VEGF的PP6单独培养，并设立成纤维细胞组作为阴性对照，以及CCSMC组作为阳性对照。
7 N+ G5 g3 C7 M9 p, u" D4 W. u4 _  Q; ~- W5 S6 Y+ H
增殖培养基：20％的胎牛血清、20％马血清、80％DMED-LG
. ^# D) \1 o& ]) m/ @! J2 E9 x) R6 x+ B5 _2 X" W, Z2 s

  t# R# r) ~" @) q$ j/ ]3 b, KQu Z,Balkir L,Van Deutekom JC,et al. Development of approaches to improve cell survival in myoblast transfer therapy.J Cell Biol.1998,142:1257-1267

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CD34+CD38-的干细胞向 粒系的诱导分化:
3 h! W- o$ O( z4 ~/ \4 s细胞培养体系为lml,200微升的胎牛血清,800微升的IMEM,SCF 10ng, IL-3 5ng,
1 n& S' U! z: RGM-CSF 5ng, G-CSF 5000U,前面三个因子是peprotech公司的,后一细胞因子就是临床的瑞白.在诱导的第七天可见所有的细胞都表达CD33,在诱导的14天可见90%的细胞CD15明显表达!

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脐血造血干细胞诱导分化为巨核细胞. K& g% b- r2 W& S' }5 Y
x123u：脐血造血干细胞诱导分化为巨核细胞& @9 {3 W8 ?: s# u$ t5 v+ B' i/ W

1 Z8 v0 r2 [6 O( g2 u  j1．用含肝素抗凝的无菌干燥瓶收集，采血量为80-100 ml。
! r) \; l7 I1 M+ V, C$ t
" w: o% b( g$ R% R2．细胞因子：TPO、FLT3-L 、IL-3、IL-6和SCF。( R" p9 @' Y6 B  p" h9 {/ A
0 o! c2 t# C* F/ N2 f- R" L1 K! f
3．应用免疫磁珠MACS方法分离脐血CD34＋细胞，然后取部分细胞进行流式细胞仪测定、鉴定和分离纯度。( @/ A9 R& B' a

* v5 l/ y2 k, [1 }9 E4．诱导方案：CD41＋细胞的体外诱导扩增用含10％ FCS和5×10 mol/L二巯基乙醇的IMDM，将CD34＋细胞浓度调整为2×10/ml，加入24孔板，每孔终体积为1mL。细胞因子组合为：TPO+SCF+ IL3+IL6，细胞因子的终浓度为：IL3 10 ng/ml，IL-6 10 ng/ml，SCF 50 ng/ml，TPO 10 ng/ml，FLT-3L 10 ng/ml。将上述扩增体系置37度饱和湿度CO2培养箱中培养，每3天半量换液1次，添加全量的造血生长因子，培养3周，在培养的第7天或14天测定培养体系的总细胞数，用流式细胞仪测定 CD41＋细胞的含量即为巨核细胞。" y( N  v) e/ P! u. V* |5 G
, @7 ]/ a2 j; L. n" R# W& i
5．甲基纤维素半固体培养法培养对CD41＋细胞进行集落培养以进一步鉴定。
: y. _& y: ^6 ]( D
( p8 G8 T& i* z$ D4 Y参考文献：; ~5 W& k4 {# y6 C3 r. F
1.Williams JL．Pipia GG ，Datta NS，et al. Thrombopoietin rquires additional mgakaryocyte-active cytokines for optimal，ex vivo expansion of megakaryocyte precursor cyells．Blood，1998；91：4118-4l26.
3 l' \3 L, k( S! s! |! N2.Li K．Yan g M，Lam AC，et al. Efects offit3 ligan d in combination with TPO on the expan sion of megakaryocytic progenitors．Cell Transplant，2000；9：125-131.

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zeronepl. X6 k+ \; U! y5 ]
1.1 BMSCs向成骨细胞诱导分化
% w) J8 z5 h& |2 \诱导剂主要有10-8mol/L地塞米松、50μg/ml抗坏血酸、10mmol/L β-甘油磷酸钠、FBS和DMEM-LG液。
% a6 ]: Q+ Z: k. l  N% s1.2 BMSCs向软骨细胞诱导分化
6 l, x. L9 ^3 C诱导剂主要有胰岛素、转铁蛋白、牛血清白蛋白、丙酮酸钠、亚油酸、维生素C、地塞米松、TGF-β。8 t7 m. y5 j; Q% r) v( G
1.3 BMSCs向脂肪细胞诱导分化  [2 B6 V; x+ z( f4 W
诱导剂主要有1-甲基-3-异丁基黄嘌呤、胰岛素、地塞米松和消炎痛等。% m+ Z, ^+ d6 h
1.4 BMSCs向神经细胞诱导分化
( ]: U# y. f" K# T诱导剂主要有β-巯基乙醇、二甲基亚砜、丁化羟基苯甲醚。: z3 q* \  D. P# H
1.5 BMSCs向内皮细胞诱导分化/ M  E7 H. i7 z9 o
诱导剂主要有胰岛素、转铁蛋白、硒、牛血清白蛋白、地塞米松、2-磷酸抗坏血酸及微量VEGF等。$ b" n2 t8 O' O, E
1.6 BMSCs向肝细胞诱导分化2 T4 T; ^/ {. r) n
1.7 BMSCs向心肌细胞诱导分化1 ~- N. y7 I4 E& B: s; k6 R9 E
诱导剂主要有5-氮胞苷。' {7 X/ H1 w& P, Y7 _
1.8 BMSCs向胰岛细胞诱导分化
1 e) B# p  h/ Q诱导剂主要有β-巯基乙醇、尼克酰胺、B27。