MSC诱导分化专题

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样本:1 S5 A. |2 n8 x8 o: o
MSC向成骨细胞的诱导分化/ N1 w. Y/ J4 ~% G
(1)取P2代MSC在传代的同时以2×104/cm2的密度接种于24孔板中，每孔加入15%FBS，1ng/ml bFGF的低糖DMEM培养液0.8ml；- k; E0 K& T; M- X0 G) v* M
(2)待细胞达80%融合，换为诱导培养液(高糖DMEM, 地塞米松 10-8M, β-磷酸甘油1.5mg/ml,抗坏血酸50μg/ml)，以后每3～4d换一次液；
$ \2 z% t- `: C, ^+ K(3)2w后进行茜素S染色鉴定。+ L# L. _0 z+ ^* R( H" M8 i% @
3.2.3 MSC向脂肪细胞的诱导分化5 F9 {: O, p  t
(1)取P2代MSC在传代的同时以2×104/cm2的密度接种于24孔板中，每孔加入15%FBS，1ng/ml bFGF的低糖DMEM培养液0.8ml；; s; o4 y, d% k3 p
(2)待细胞达80%融合，换为诱导培养液(高糖DMEM, FBS 15%, 胰岛素 10ng/ul)，以后每3～4d换一次液；
% ]# _7 K( O, u, {- _8 m(3)2w后进行苏丹Ⅳ染色鉴定。
6 U/ J% ~& e9 R4 d4 M2 vMSC的成骨和成脂肪的检测$ k$ Q- E& _# y5 I0 S5 o6 L2 N: m1 J
茜素S染色方法
$ A0 N5 k* f6 \(1)吸去培养液，PBS洗2次，每次5min;2 X& l" M, s2 |9 I
(2)90%乙醇固定15min，蒸馏水洗2次；1 i% ]" {, ?4 {: `$ H
(3)茜素S染色8min，蒸馏水洗2次,70%、95%及100%的乙醇分别固定5min,甘油封片。
7 B0 K* |& |- ]$ c4 K1 \苏丹Ⅳ染色方法
; p! R/ Q& s8 W( L1 ?6 i(1)吸去培养液后用PBS洗2次，每次5min；0 u0 K9 w: p; y
(2)10%甲醛固定15min，蒸馏水洗2次；1 O4 [& f, U: j( T
(3)苏丹Ⅳ染色8min，蒸馏水洗2次,苏木精染色10min，自来水洗。甘油封片。

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成软骨细胞的诱导4 t4 m' c( E/ t9 g" V- z3 H
选前 三 代 生长良好的MSCs，消化后制成单细胞悬液，以3X 1 0"/ml的密度接
; [* D& d8 A4 E" ?4 d种于 细胞瓶中，待细胞达到80-90%融合后，每隔三天换液一次，倒置显微镜下观察 。14 天后 终止诱导。提取总RNA，设计II型前胶元的引物序列，COL(I I) 上游:5 ' -TTC AGC TAT GGA GAT GAC AAT C-3‘，下游:5’-AGA GTC CTA GAG TGA CTGAG-3 ，产物片断4756p，进行RT-PCR扩增。其产物经琼脂糖凝胶电泳后观察，检测II型前胶元mRNA的表达。
, x, C2 z+ Z) F/ w3 I( s, R: L$ L软骨细胞诱导液:
7 P3 X- T" _9 yDEM E 高糖 培养液，10%胎牛血清，100u/ml青霉素，l00g/ml链霉素，TGF3 q) j7 m* H1 {5 p; c1 l; ]
-P }10ng/ml，抗坏血酸50ug/mla

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体外诱导MSCs向神经细胞分化
; g1 a. s5 `/ D7 s& }体外诱导MSCs向神经细胞分化
4 |$ p! ?; ?- [1 n3 q取体 外扩增至第2代的MScs，以lx105/ml浓度接种于放置有消毒盖玻片9 c4 d0 n+ b: m# W+ F4 J
的6孔板内，制备细胞爬片。lw后进行诱导:加10ng/1lllEGF+含10%FBs5 G2 e$ Z, y! u  v) ^  }
的培养液预诱导3d，加lm oFLBME+含10%FBS的培养液预诱导ld，24h
' w2 G6 A+ A, U+ M后加1林mo比声JRA+含10%FBs的培养液进行诱导。诱导24h后密切观察，可见多数细胞形成明显的神经元样细胞形态，胞体呈圆形，突起较长，双极或多极形，在突起末端出现分支，部分相邻细胞的突起连接成网。

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选择合适的代数（P3-5代）进行多向诱导分化1 `' f1 A* F6 W- ^3 T, X
成骨诱导培养液的配置：含10%FBS的α-MEM培养液中添加50 μM 抗坏血酸, 10mmβ-磷酸甘油 和 100nm 地塞米松；取P4细胞，按照5×103个/cm2接种6孔板，在生长培养液（α-MEM培养液）中长到基本融合时，更换成成骨诱导培养液，每3d换液，于 7d时进行碱性磷酸酶染色，28d时进行矿化结节的茜素红染色。
' \$ @0 Q# a+ \/ Q' z茜素红染色：吸去培养液，PBS冲洗两遍；10%甲醛实温固定15min； ddH2O冲洗两遍； 加入1ml/孔的40mM的茜素红染色液，室温孵育 20min并轻微振荡；吸取未结合的燃料，用ddH2O漂洗并振荡5min重复4次；倾斜放置2min,吸取多余的ddH2O；倒置显微镜观察拍照记录。
4 w: |( ~2 F& F0 d- Q) f, j$ h* H: @+ q6 y( b  |
成脂诱导培养液的配置：含10%FBS的HG-DMEM培养液中添加1μM地塞米松,10μg/ml胰岛素，200μM吲哚美辛和0.5mM IBMX；取P4细胞，按照2×104个/cm2接种6孔板，在生长培养液（HG-DMEM培养液）中长到基本融合时，更换成脂诱导培养液诱导2d,再用只含有10μg/ml胰岛素的成脂维持液培养1d，如此循环培养至14天，进行油红O染色。; c( Z; J! [% \. u' T2 ^
油红O染色：吸去培养液，PBS冲洗两遍；27.5%甲醛室温固定20min；ddH2O冲洗三遍，空气干燥；加入0.5%的油红O,室温孵育1h；70%乙醇洗涤3次；倒置显微镜观察拍照记录。

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肝样细胞诱导分化[1~3]+ w3 T0 d) t6 i- T2 i; _
DMEM中补充bFGF\HGF分别至20ng/ml和10ng/ml，3天换液一次，重新补充因子，在7天左右可以检测得到肝特异基因，蛋白AFP，ALB等的表达
% y' @" A$ [! j8 G+ ~4 o; h
+ v6 P# u+ x0 s2 }/ ^. }9 K1.Shin-Yeu Onga, Hui Daia, Kam W. Leonga,b, Inducing hepatic differentiation of human mesenchymal stem cells in pellet culture. Biomaterials. 2006, 4087–40974 C3 w) o! a2 I$ K
2. Taléns-Visconti a, A. Bonora a, R. Jover a, V. Mirabet b, F. Carbonell b.
0 D! M/ B- B( O# N8 ?- t& qHuman mesenchymal stem cells from adipose tissue: DiVerentiation, D$ x" U7 h( ^4 D5 h3 @
into hepatic lineage .oxicology in Vitro 21 (2007) 324–3292 f7 C* J* d# a6 i
3.Qing-Jun Zhoua, Yan-Dan Huanga,1, Li-Xin Xiang. In vitro differentiation of embryonic stem cells into hepatocytes induced by fibroblast growth factors. the International Journal of Biochemistry & Cell Biology ,2007,1714–1721

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2.rMSCs成骨和脂肪细胞诱导分化
  O& I* m# q, c- W$ l( T- e2.1体外定向诱导rMSCs分化为成骨细胞
) F6 x* Z' k5 J; J- Z' J( S0 ?以接种密度为4×103/cm2将P3代rMSCs接种于预先置有盖玻片的6孔板内以制备细胞爬片。待细胞融合达80%,吸去孔内培养液,实验组每孔加入成骨条件培养基2mL置培养箱中,隔天换液1次，共诱导3周。对照组加入含10%胎牛血清(FCS)的L-DMEM培养液。3周末应用茜素红S染色法检测钙沉积。
, T) l( g9 j: n( l4 b# Q茜素红S染色法步骤：* M6 t5 C. g, C1 [
(1)诱导第21天,吸去成骨条件培养基,PBS洗涤3次
% q+ ^7 F3 t6 e' R& S(2)茜素红染2min。4 y& U  f, B5 d( s* C+ |
(3)蒸馏水洗5-10s。6 w! Y; f# A; e
(4)分化液洗15s。6 l/ n# D. d9 L, S! s) b
(5)PBS洗涤3次，显微镜下观察并拍照。) |& C! V9 T3 X% \
2.2体外定向诱导rMSCs分化为脂肪细胞$ j. ]3 G- N9 T8 G/ F$ Y& A' u- M
以4 ×103/cm2将P3代rMSCs密度接种于预先置有盖玻片的6孔板内以制备细胞爬片。细胞达到80％融合后,加入成脂条件培养基2 mL置培养箱中,隔天换液1次，共诱导3周。对照组加入含10%胎牛血清(FCS)的L-DMEM培养液。3周末应用油红O染色法检测脂滴形成
1 v# {8 J- A: `. _油红O染色法步骤：3 {6 h6 u, f6 K' U! H" E
(1)细胞爬片用PBS清洗两次，每次5min;3 V$ e7 v+ _2 Z4 s
(2)4%多聚甲醛固定15 min;! w  i2 T) v+ d8 w
(3)PBS漂洗两次，每次5min;
, U6 f1 ^. c8 _! U' ?7 M(4)入60%异丙醇漂洗。
/ K! V# T: i. `, |( e1 v(5)入油红O染色15分钟。  ]: b+ S4 x! x! N9 A9 H* X" _8 ]
Devil60%异丙醇漂洗。
( j$ ?/ T) h; M( ^, `
& [+ k# O0 v- w9 \, U# r) ^! z4 R3.rMSCs成肌细胞诱导分化2 N" S# X  u) ]0 }
以4 ×103/cm2将P3代rMSCs密度接种于预先置有盖玻片的6孔板内以制备细胞爬片。细胞达到80％融合后,加入含五氮杂胞苷（10umol/L，用 PBS配制）的DMEM2 mL置培养箱培养24小时,然后换用含有2%马血清的DMEM培养基培养7——10天。对照组换用PBS诱导24小时后，加入含2%马血清的L-DMEM 培养液。鉴定：可用MHC,MYOD,MYOGENIN,MHC等肌性标记物行免疫荧光染色。/ r% T! r; D# Q& D
参考文献：1.Wakitani, S., T. Saito, and A.I. Caplan, Myogenic cells derived from rat bone marrow mesenchymal stem cells exposed to 5-azacytidine. Muscle Nerve, 1995. 18(12): p. 1417-26.

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新西兰大白兔的肌源性干细胞MDSC诱导分化平滑肌细胞SMC
/ d0 Y/ G" L9 Z' g( l+ ^一、利用差速贴壁法分离兔MDSC及鉴定：
5 p/ g# S3 @! H1、根据Qu～1方法改进：麻醉1.5个月龄2.0kg新西兰兔，无菌切取10g大腿肌肉，剪成肉泥并置入15ml无菌离心管中。4 t9 B9 m0 W0 Q; O, A4 k5 T6 G
2、分别用0.2％的ⅩⅠ型胶原酶消化1h、dispase消化45min以及0.1%trypsin消化30min。/ T" `1 G! J' \7 i  _7 i
3、消化均在37℃恒温培养箱内进行，每次消化指间需离心并取沉淀进行下一步消化。, Q. F0 t# ]8 B) c; c/ \) F2 C+ ^, V
4、消化后的沉淀用增殖培养基重悬，并接种在用胶原（0.1％鼠尾胶溶液，自制）包被的培养瓶中，该瓶称为PP1。
% ?7 p5 t3 u; x3 S8 i$ U5、PP1于37℃、5％CO2的细胞培养箱中静置过夜，随后将悬液转移到另一个胶原包被的培养瓶中培养，称为PP2。1 l+ |% n( L* W/ }* G" W' @7 T: }
6、此后连续4d每隔24h将悬液离心、重悬后转移至新的培养瓶中，分别为PP3-PP6。* s8 x# g8 U) B5 z
7、PP1-PP5弃去不用，PP6用于进一步诱导分化实验，细胞在达到约30％汇合时必须传代，继续接种至胶原预包被的新培养瓶内加入增殖培养基进行培养。  C" _1 l/ M* n' V* V
8、PP6在汇合度达到30%前进行细胞表型鉴定，分别采用FCM检测desmin、CD45、bcl-2的阳性细胞数百分率。
' M! V" C5 r5 ?9、采用免疫细胞化学检测desmin的表达情况。
& a" V; }8 W! O6 z6 C) K二、诱导分化实验：
6 K' [# H' {  _: e2 u/ m取PP6进行诱导，采用两种方法：' C( @, ]$ d; c  e
3 f) h8 S. z8 ?' {$ n* w0 {" P
1、共培养诱导：% t: p- ]1 K0 C
细胞消化后离心去上清，用浓度为5mg/L的Hoechst33342（用增殖培养基配制）重悬，避光并在细胞培养箱内孵育20min，随后离心去上清，用增殖培养基重悬，调整密度至1x10~3个/ml，接种到6孔板，每个孔内加入等量的兔阴茎海绵体平滑肌细胞CCSMC进行共培养，2d后进行免疫组化检测α－SMA表达情况。
3 A3 o7 V/ p, [$ w另设一组对称的未处理组，即PP6单独培养组，以及CCSMC组作为阳性对照，进行激光共聚焦显微镜观察及拍照。) h& r- i$ o0 N( M+ j
2、直接诱导：
* H& M$ ?9 @, |8 A6 _! ]3 R细胞消化下来后接种到6孔板，并且添加VEGF，使其在每孔的终浓度为25ug/L，置入培养箱，2d后进行免疫细胞化学以及Western blot法检测α－SMA表达情况（选用GAPDH作为内参）。# x# U% y4 p, u* j; c1 ^" c) i
同时另设一对称的未处理组，即未添加VEGF的PP6单独培养，并设立成纤维细胞组作为阴性对照，以及CCSMC组作为阳性对照。
: z4 p3 v3 E, c2 Z
  M8 w! k) u5 X, X% i增殖培养基：20％的胎牛血清、20％马血清、80％DMED-LG
( x7 H  s4 V" l9 P" ?
4 A7 e/ X  K  k  v8 G) o  k2 y* g( y
Qu Z,Balkir L,Van Deutekom JC,et al. Development of approaches to improve cell survival in myoblast transfer therapy.J Cell Biol.1998,142:1257-1267

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CD34+CD38-的干细胞向 粒系的诱导分化:
4 |) K: h# @  T8 b  _% ?) @1 M5 ]) m细胞培养体系为lml,200微升的胎牛血清,800微升的IMEM,SCF 10ng, IL-3 5ng,7 @: l& B7 W& z# f
GM-CSF 5ng, G-CSF 5000U,前面三个因子是peprotech公司的,后一细胞因子就是临床的瑞白.在诱导的第七天可见所有的细胞都表达CD33,在诱导的14天可见90%的细胞CD15明显表达!

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脐血造血干细胞诱导分化为巨核细胞
% f, s; W0 `+ O  g% O. ]x123u：脐血造血干细胞诱导分化为巨核细胞
6 \" X/ n9 ^9 I# s% W" F
. H% d+ @8 \- |, K! U$ e9 u1．用含肝素抗凝的无菌干燥瓶收集，采血量为80-100 ml。
) z( l8 T% j3 O+ z: I9 ]; `! c* L  }
2．细胞因子：TPO、FLT3-L 、IL-3、IL-6和SCF。
- A7 z  F; j% b  }
, E! C7 ]3 z+ I" @3．应用免疫磁珠MACS方法分离脐血CD34＋细胞，然后取部分细胞进行流式细胞仪测定、鉴定和分离纯度。0 c* W( ^5 T' t9 X4 h: P
$ m1 m" {+ P# d$ K, V( h* k
4．诱导方案：CD41＋细胞的体外诱导扩增用含10％ FCS和5×10 mol/L二巯基乙醇的IMDM，将CD34＋细胞浓度调整为2×10/ml，加入24孔板，每孔终体积为1mL。细胞因子组合为：TPO+SCF+ IL3+IL6，细胞因子的终浓度为：IL3 10 ng/ml，IL-6 10 ng/ml，SCF 50 ng/ml，TPO 10 ng/ml，FLT-3L 10 ng/ml。将上述扩增体系置37度饱和湿度CO2培养箱中培养，每3天半量换液1次，添加全量的造血生长因子，培养3周，在培养的第7天或14天测定培养体系的总细胞数，用流式细胞仪测定 CD41＋细胞的含量即为巨核细胞。
9 F' r, ^9 U$ a7 @) r) X
8 f" U9 y; S3 f$ q' R5．甲基纤维素半固体培养法培养对CD41＋细胞进行集落培养以进一步鉴定。0 q, p6 i7 x+ o5 R5 r; b

4 F; O7 f% @' r8 M参考文献：+ `( b/ j* u/ v- v( K. E; C* m! M
1.Williams JL．Pipia GG ，Datta NS，et al. Thrombopoietin rquires additional mgakaryocyte-active cytokines for optimal，ex vivo expansion of megakaryocyte precursor cyells．Blood，1998；91：4118-4l26.0 ^4 M/ D' F# E
2.Li K．Yan g M，Lam AC，et al. Efects offit3 ligan d in combination with TPO on the expan sion of megakaryocytic progenitors．Cell Transplant，2000；9：125-131.

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zeronepl
% Q: D: l' r" S' V, t6 n8 O+ `# b1.1 BMSCs向成骨细胞诱导分化2 D' ~- K$ l/ y) Y
诱导剂主要有10-8mol/L地塞米松、50μg/ml抗坏血酸、10mmol/L β-甘油磷酸钠、FBS和DMEM-LG液。
% B- h& x) i- k7 x; K1.2 BMSCs向软骨细胞诱导分化$ A5 f# Z3 e! ?$ z0 f/ g# u1 s* |
诱导剂主要有胰岛素、转铁蛋白、牛血清白蛋白、丙酮酸钠、亚油酸、维生素C、地塞米松、TGF-β。
8 a9 n! E9 L5 G) N7 O/ s) I1.3 BMSCs向脂肪细胞诱导分化* @- U: d; V8 }5 E
诱导剂主要有1-甲基-3-异丁基黄嘌呤、胰岛素、地塞米松和消炎痛等。
& [- z% m0 U- E" z) ~7 j1.4 BMSCs向神经细胞诱导分化' t/ j7 L& _& Y- u* c* f1 c
诱导剂主要有β-巯基乙醇、二甲基亚砜、丁化羟基苯甲醚。
, A' G3 |! U1 ]+ |8 h/ L7 Z1.5 BMSCs向内皮细胞诱导分化- {0 |* c0 n' F- h1 \5 h* p! p
诱导剂主要有胰岛素、转铁蛋白、硒、牛血清白蛋白、地塞米松、2-磷酸抗坏血酸及微量VEGF等。
: z3 K: c4 H# s1.6 BMSCs向肝细胞诱导分化  ^& r; C4 p5 C4 S* {$ @
1.7 BMSCs向心肌细胞诱导分化
0 K5 R/ ?' x( R9 \% L, V诱导剂主要有5-氮胞苷。
: }) J* I! T) h; s$ q1.8 BMSCs向胰岛细胞诱导分化$ F+ B( N* }; u+ D: D" J8 B6 o
诱导剂主要有β-巯基乙醇、尼克酰胺、B27。