MSC诱导分化专题

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样本:4 D2 K) B! O, U# P0 I) J
MSC向成骨细胞的诱导分化
" X; j' P0 P) K  Z5 y7 w(1)取P2代MSC在传代的同时以2×104/cm2的密度接种于24孔板中，每孔加入15%FBS，1ng/ml bFGF的低糖DMEM培养液0.8ml；
) _& g9 N# E! k" e; t3 G4 B/ v(2)待细胞达80%融合，换为诱导培养液(高糖DMEM, 地塞米松 10-8M, β-磷酸甘油1.5mg/ml,抗坏血酸50μg/ml)，以后每3～4d换一次液；
0 h1 F1 g( }4 c0 M* V7 B(3)2w后进行茜素S染色鉴定。& v( R" a( c/ w/ n4 u
3.2.3 MSC向脂肪细胞的诱导分化8 X+ X0 q, S! {( n( _; K. a( C
(1)取P2代MSC在传代的同时以2×104/cm2的密度接种于24孔板中，每孔加入15%FBS，1ng/ml bFGF的低糖DMEM培养液0.8ml；* H8 U, Z4 ~$ \  ^$ V6 ~8 x- D% ~
(2)待细胞达80%融合，换为诱导培养液(高糖DMEM, FBS 15%, 胰岛素 10ng/ul)，以后每3～4d换一次液；
' `" {& o9 k5 `' m8 r8 M(3)2w后进行苏丹Ⅳ染色鉴定。
6 L, z, J2 g, K4 I  |MSC的成骨和成脂肪的检测9 c  |+ E% C* E0 T2 k% p+ a* y8 ^
茜素S染色方法& \! T9 I* v! l
(1)吸去培养液，PBS洗2次，每次5min;
/ y; a, x8 j' @: e(2)90%乙醇固定15min，蒸馏水洗2次；# D4 {  R6 y: d. ]$ Y3 Q0 N# b$ U
(3)茜素S染色8min，蒸馏水洗2次,70%、95%及100%的乙醇分别固定5min,甘油封片。( u& p% {$ T4 b" n( {- a+ C7 ?
苏丹Ⅳ染色方法
3 h3 r2 y- N0 U3 p7 O(1)吸去培养液后用PBS洗2次，每次5min；
/ J8 u% s" E. K( O) \. k(2)10%甲醛固定15min，蒸馏水洗2次；6 y: y9 J; O9 L1 O' v
(3)苏丹Ⅳ染色8min，蒸馏水洗2次,苏木精染色10min，自来水洗。甘油封片。

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成软骨细胞的诱导
: Y5 _1 b; N' L7 k& s0 I' J# D3 [选前 三 代 生长良好的MSCs，消化后制成单细胞悬液，以3X 1 0"/ml的密度接# O8 U) |  Z9 Z0 I3 M+ m
种于 细胞瓶中，待细胞达到80-90%融合后，每隔三天换液一次，倒置显微镜下观察 。14 天后 终止诱导。提取总RNA，设计II型前胶元的引物序列，COL(I I) 上游:5 ' -TTC AGC TAT GGA GAT GAC AAT C-3‘，下游:5’-AGA GTC CTA GAG TGA CTGAG-3 ，产物片断4756p，进行RT-PCR扩增。其产物经琼脂糖凝胶电泳后观察，检测II型前胶元mRNA的表达。8 c6 j) `, y) F6 q1 b) S! w: Q
软骨细胞诱导液:) C/ }4 ^5 h1 b  i# ~- ^& D
DEM E 高糖 培养液，10%胎牛血清，100u/ml青霉素，l00g/ml链霉素，TGF
: j5 q8 D# g# [' C' _! {# w* a-P }10ng/ml，抗坏血酸50ug/mla

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体外诱导MSCs向神经细胞分化# Y# y; Y& v* y3 K1 |7 B2 ^/ T
体外诱导MSCs向神经细胞分化
& E- _3 L: T" C' J4 k取体 外扩增至第2代的MScs，以lx105/ml浓度接种于放置有消毒盖玻片
/ Q- w# K( s% m的6孔板内，制备细胞爬片。lw后进行诱导:加10ng/1lllEGF+含10%FBs# g- C8 q' E# t$ x
的培养液预诱导3d，加lm oFLBME+含10%FBS的培养液预诱导ld，24h0 ?7 h# \0 q- i' Q+ b5 P: v
后加1林mo比声JRA+含10%FBs的培养液进行诱导。诱导24h后密切观察，可见多数细胞形成明显的神经元样细胞形态，胞体呈圆形，突起较长，双极或多极形，在突起末端出现分支，部分相邻细胞的突起连接成网。

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选择合适的代数（P3-5代）进行多向诱导分化
2 J8 R" @$ q% N- B' x2 X  o% y成骨诱导培养液的配置：含10%FBS的α-MEM培养液中添加50 μM 抗坏血酸, 10mmβ-磷酸甘油 和 100nm 地塞米松；取P4细胞，按照5×103个/cm2接种6孔板，在生长培养液（α-MEM培养液）中长到基本融合时，更换成成骨诱导培养液，每3d换液，于 7d时进行碱性磷酸酶染色，28d时进行矿化结节的茜素红染色。
0 c; C- |. V: {% Q茜素红染色：吸去培养液，PBS冲洗两遍；10%甲醛实温固定15min； ddH2O冲洗两遍； 加入1ml/孔的40mM的茜素红染色液，室温孵育 20min并轻微振荡；吸取未结合的燃料，用ddH2O漂洗并振荡5min重复4次；倾斜放置2min,吸取多余的ddH2O；倒置显微镜观察拍照记录。
* G; c6 _9 R, x2 j/ R$ @+ N
) i7 W4 _5 P/ r! E1 L# L( ]& l/ ^, H成脂诱导培养液的配置：含10%FBS的HG-DMEM培养液中添加1μM地塞米松,10μg/ml胰岛素，200μM吲哚美辛和0.5mM IBMX；取P4细胞，按照2×104个/cm2接种6孔板，在生长培养液（HG-DMEM培养液）中长到基本融合时，更换成脂诱导培养液诱导2d,再用只含有10μg/ml胰岛素的成脂维持液培养1d，如此循环培养至14天，进行油红O染色。
1 h* O) Z3 \& D# m/ ?' G9 ^* ]油红O染色：吸去培养液，PBS冲洗两遍；27.5%甲醛室温固定20min；ddH2O冲洗三遍，空气干燥；加入0.5%的油红O,室温孵育1h；70%乙醇洗涤3次；倒置显微镜观察拍照记录。

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肝样细胞诱导分化[1~3]
" G& G4 X! g* h7 c3 o1 MDMEM中补充bFGF\HGF分别至20ng/ml和10ng/ml，3天换液一次，重新补充因子，在7天左右可以检测得到肝特异基因，蛋白AFP，ALB等的表达; ~9 C( C) R# E  y# G. j' C

- F" e4 I+ B; a2 ]( k: [# h- g1.Shin-Yeu Onga, Hui Daia, Kam W. Leonga,b, Inducing hepatic differentiation of human mesenchymal stem cells in pellet culture. Biomaterials. 2006, 4087–4097; x5 c- t7 \: C. _. n
2. Taléns-Visconti a, A. Bonora a, R. Jover a, V. Mirabet b, F. Carbonell b.
$ Y7 L) @* k$ E' UHuman mesenchymal stem cells from adipose tissue: DiVerentiation
4 `4 I: x, w- K" ^0 K$ J, v2 ~7 Pinto hepatic lineage .oxicology in Vitro 21 (2007) 324–329% q0 o" N8 h8 j$ P: k$ ]4 I) C! v8 d
3.Qing-Jun Zhoua, Yan-Dan Huanga,1, Li-Xin Xiang. In vitro differentiation of embryonic stem cells into hepatocytes induced by fibroblast growth factors. the International Journal of Biochemistry & Cell Biology ,2007,1714–1721

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2.rMSCs成骨和脂肪细胞诱导分化, c1 d# c7 N  k/ e* z
2.1体外定向诱导rMSCs分化为成骨细胞
7 o. ~) [( m0 ^4 @4 R3 n7 u以接种密度为4×103/cm2将P3代rMSCs接种于预先置有盖玻片的6孔板内以制备细胞爬片。待细胞融合达80%,吸去孔内培养液,实验组每孔加入成骨条件培养基2mL置培养箱中,隔天换液1次，共诱导3周。对照组加入含10%胎牛血清(FCS)的L-DMEM培养液。3周末应用茜素红S染色法检测钙沉积。
. B. {$ E* q) v7 c% Y5 q7 c茜素红S染色法步骤：- J- k2 }0 u8 x, l# i4 \. X; u$ w
(1)诱导第21天,吸去成骨条件培养基,PBS洗涤3次( }5 I4 ^( {, D, `1 [" q, [
(2)茜素红染2min。
) y& p2 g& p0 g( F6 \4 V(3)蒸馏水洗5-10s。
, a$ l+ Z" \- I(4)分化液洗15s。
/ ]' M& z/ ^) M0 j( S, o  N  o2 o(5)PBS洗涤3次，显微镜下观察并拍照。
% k/ z3 S/ |5 H/ i+ M# M: q' C' g2.2体外定向诱导rMSCs分化为脂肪细胞) G2 g! Y, ~& q0 L
以4 ×103/cm2将P3代rMSCs密度接种于预先置有盖玻片的6孔板内以制备细胞爬片。细胞达到80％融合后,加入成脂条件培养基2 mL置培养箱中,隔天换液1次，共诱导3周。对照组加入含10%胎牛血清(FCS)的L-DMEM培养液。3周末应用油红O染色法检测脂滴形成
7 X* Y! `3 M5 b7 ^3 R油红O染色法步骤：
$ I6 c: E' Q. M" D' _. H1 n5 W7 D- t(1)细胞爬片用PBS清洗两次，每次5min;1 N/ i' Q# ~! U3 W" E: ^
(2)4%多聚甲醛固定15 min;
3 d5 }% |9 K5 g(3)PBS漂洗两次，每次5min;" R8 Q) [% E, `9 O7 H7 k
(4)入60%异丙醇漂洗。
8 q' P- E; s# \$ ^) K(5)入油红O染色15分钟。
. G3 g2 @: G. _Devil60%异丙醇漂洗。: {& }( p0 ?- S5 h, l
9 ^5 r4 N0 X' W
3.rMSCs成肌细胞诱导分化2 B1 s/ J% ~  G: z9 d) i
以4 ×103/cm2将P3代rMSCs密度接种于预先置有盖玻片的6孔板内以制备细胞爬片。细胞达到80％融合后,加入含五氮杂胞苷（10umol/L，用 PBS配制）的DMEM2 mL置培养箱培养24小时,然后换用含有2%马血清的DMEM培养基培养7——10天。对照组换用PBS诱导24小时后，加入含2%马血清的L-DMEM 培养液。鉴定：可用MHC,MYOD,MYOGENIN,MHC等肌性标记物行免疫荧光染色。
/ x" p* N) [( g/ D参考文献：1.Wakitani, S., T. Saito, and A.I. Caplan, Myogenic cells derived from rat bone marrow mesenchymal stem cells exposed to 5-azacytidine. Muscle Nerve, 1995. 18(12): p. 1417-26.

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新西兰大白兔的肌源性干细胞MDSC诱导分化平滑肌细胞SMC
- f- V4 p, a* C; J一、利用差速贴壁法分离兔MDSC及鉴定：9 g4 j# E' Y' U: S+ E) M6 `
1、根据Qu～1方法改进：麻醉1.5个月龄2.0kg新西兰兔，无菌切取10g大腿肌肉，剪成肉泥并置入15ml无菌离心管中。- u9 O7 V/ d7 b/ |
2、分别用0.2％的ⅩⅠ型胶原酶消化1h、dispase消化45min以及0.1%trypsin消化30min。, f2 V0 C: G+ b6 r' f5 \
3、消化均在37℃恒温培养箱内进行，每次消化指间需离心并取沉淀进行下一步消化。) \' }$ i2 S2 m* i( c* G
4、消化后的沉淀用增殖培养基重悬，并接种在用胶原（0.1％鼠尾胶溶液，自制）包被的培养瓶中，该瓶称为PP1。* f4 F5 A' p9 ]1 N
5、PP1于37℃、5％CO2的细胞培养箱中静置过夜，随后将悬液转移到另一个胶原包被的培养瓶中培养，称为PP2。
: b* l+ }) p" q$ [0 C' F. q6、此后连续4d每隔24h将悬液离心、重悬后转移至新的培养瓶中，分别为PP3-PP6。* {) l0 |' `1 Q% W. |0 j  O0 Y6 H
7、PP1-PP5弃去不用，PP6用于进一步诱导分化实验，细胞在达到约30％汇合时必须传代，继续接种至胶原预包被的新培养瓶内加入增殖培养基进行培养。
+ E8 V, B+ s0 c  _+ D" ^0 u1 J3 w8、PP6在汇合度达到30%前进行细胞表型鉴定，分别采用FCM检测desmin、CD45、bcl-2的阳性细胞数百分率。
5 u6 l" V4 k, T" Z6 q# f  r  K9、采用免疫细胞化学检测desmin的表达情况。
: x6 F( s8 X' S二、诱导分化实验：8 f4 c9 J, ~# s/ E
取PP6进行诱导，采用两种方法：
( a( o$ f- X( j% i2 ]2 o1 l
6 v* n* u$ D. @3 ]/ N& d) I1、共培养诱导：  t' E+ n& w' k5 u
细胞消化后离心去上清，用浓度为5mg/L的Hoechst33342（用增殖培养基配制）重悬，避光并在细胞培养箱内孵育20min，随后离心去上清，用增殖培养基重悬，调整密度至1x10~3个/ml，接种到6孔板，每个孔内加入等量的兔阴茎海绵体平滑肌细胞CCSMC进行共培养，2d后进行免疫组化检测α－SMA表达情况。0 A% c+ A+ d# s) e* s
另设一组对称的未处理组，即PP6单独培养组，以及CCSMC组作为阳性对照，进行激光共聚焦显微镜观察及拍照。& a, k2 C4 d; K7 R$ `  |
2、直接诱导：
. J" f4 e! z) o) L% G# G& Y! \细胞消化下来后接种到6孔板，并且添加VEGF，使其在每孔的终浓度为25ug/L，置入培养箱，2d后进行免疫细胞化学以及Western blot法检测α－SMA表达情况（选用GAPDH作为内参）。
, U: ]2 i9 l8 q6 b! E同时另设一对称的未处理组，即未添加VEGF的PP6单独培养，并设立成纤维细胞组作为阴性对照，以及CCSMC组作为阳性对照。
5 H8 L2 m  C$ B
: @* k# q* A) O* \增殖培养基：20％的胎牛血清、20％马血清、80％DMED-LG0 q+ I, W# m$ E

  R/ D2 k7 \% R: s9 r$ z+ V* @7 r+ h+ g; g5 A
Qu Z,Balkir L,Van Deutekom JC,et al. Development of approaches to improve cell survival in myoblast transfer therapy.J Cell Biol.1998,142:1257-1267

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CD34+CD38-的干细胞向 粒系的诱导分化:+ p9 E- e/ Y6 _
细胞培养体系为lml,200微升的胎牛血清,800微升的IMEM,SCF 10ng, IL-3 5ng,
+ C7 J: F1 h" o' YGM-CSF 5ng, G-CSF 5000U,前面三个因子是peprotech公司的,后一细胞因子就是临床的瑞白.在诱导的第七天可见所有的细胞都表达CD33,在诱导的14天可见90%的细胞CD15明显表达!

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脐血造血干细胞诱导分化为巨核细胞* a/ ^+ y4 K3 J4 d8 ?) e
x123u：脐血造血干细胞诱导分化为巨核细胞- V  i4 J; ^; N' q# q) e# {- a* r

& B0 g* H" h# b3 q1．用含肝素抗凝的无菌干燥瓶收集，采血量为80-100 ml。
6 t" \" a5 N* H1 Z( z, o
: }  l2 R# }; N2．细胞因子：TPO、FLT3-L 、IL-3、IL-6和SCF。
; p% u5 L1 ]* D5 m( L+ s5 o2 K2 B+ F9 Q8 ^7 H. N. K- ^1 L
3．应用免疫磁珠MACS方法分离脐血CD34＋细胞，然后取部分细胞进行流式细胞仪测定、鉴定和分离纯度。
7 }/ Q" f8 p% G7 s2 B9 x: f1 K) C0 v" A+ V4 F) |
4．诱导方案：CD41＋细胞的体外诱导扩增用含10％ FCS和5×10 mol/L二巯基乙醇的IMDM，将CD34＋细胞浓度调整为2×10/ml，加入24孔板，每孔终体积为1mL。细胞因子组合为：TPO+SCF+ IL3+IL6，细胞因子的终浓度为：IL3 10 ng/ml，IL-6 10 ng/ml，SCF 50 ng/ml，TPO 10 ng/ml，FLT-3L 10 ng/ml。将上述扩增体系置37度饱和湿度CO2培养箱中培养，每3天半量换液1次，添加全量的造血生长因子，培养3周，在培养的第7天或14天测定培养体系的总细胞数，用流式细胞仪测定 CD41＋细胞的含量即为巨核细胞。
. `  o$ R  d0 T# ?& ?, Q
* a* y& {( T" h3 |4 t0 U5．甲基纤维素半固体培养法培养对CD41＋细胞进行集落培养以进一步鉴定。% r' H, _* H. T2 n, ]

$ d, B7 t1 z+ U) J  ~0 x8 X# _4 e参考文献：
' F8 }8 @' g. `$ s1.Williams JL．Pipia GG ，Datta NS，et al. Thrombopoietin rquires additional mgakaryocyte-active cytokines for optimal，ex vivo expansion of megakaryocyte precursor cyells．Blood，1998；91：4118-4l26.
: W8 V8 W! I% Y2.Li K．Yan g M，Lam AC，et al. Efects offit3 ligan d in combination with TPO on the expan sion of megakaryocytic progenitors．Cell Transplant，2000；9：125-131.

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zeronepl; g3 \; x9 v7 A+ V$ [$ C
1.1 BMSCs向成骨细胞诱导分化( P7 n8 v- @1 ?) M* S
诱导剂主要有10-8mol/L地塞米松、50μg/ml抗坏血酸、10mmol/L β-甘油磷酸钠、FBS和DMEM-LG液。1 S" @6 s  {0 Z$ X
1.2 BMSCs向软骨细胞诱导分化. J  m9 a$ r6 z$ c, \$ H
诱导剂主要有胰岛素、转铁蛋白、牛血清白蛋白、丙酮酸钠、亚油酸、维生素C、地塞米松、TGF-β。
* V' R8 c5 h( [! D+ e( \+ U- q1.3 BMSCs向脂肪细胞诱导分化8 k2 l" V3 z! U. ?6 H) x: @8 Y; l" q
诱导剂主要有1-甲基-3-异丁基黄嘌呤、胰岛素、地塞米松和消炎痛等。
- @0 d9 O- G6 [( H/ J1.4 BMSCs向神经细胞诱导分化
. ~+ p1 D! I/ k6 ~) m4 z诱导剂主要有β-巯基乙醇、二甲基亚砜、丁化羟基苯甲醚。
& P, K: R( @$ r5 l  B: t8 [  g1.5 BMSCs向内皮细胞诱导分化1 d7 G7 A% e& M8 R6 e/ M5 v! L
诱导剂主要有胰岛素、转铁蛋白、硒、牛血清白蛋白、地塞米松、2-磷酸抗坏血酸及微量VEGF等。4 z$ t+ b, T' e- k; S' ^
1.6 BMSCs向肝细胞诱导分化
7 `9 H5 t, i. R1 G6 ?1 b1 d1.7 BMSCs向心肌细胞诱导分化8 a9 [: `: I/ p
诱导剂主要有5-氮胞苷。. X4 [6 [# U; Q* O9 p6 z# }: U
1.8 BMSCs向胰岛细胞诱导分化- h0 K* Z+ b3 m0 e) ]! b
诱导剂主要有β-巯基乙醇、尼克酰胺、B27。