MSC诱导分化专题

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样本:
3 a: a0 K3 f9 T: NMSC向成骨细胞的诱导分化( O4 Q0 H; `) [# z/ u
(1)取P2代MSC在传代的同时以2×104/cm2的密度接种于24孔板中，每孔加入15%FBS，1ng/ml bFGF的低糖DMEM培养液0.8ml；
+ M7 U0 ?0 N9 a% q0 s, s(2)待细胞达80%融合，换为诱导培养液(高糖DMEM, 地塞米松 10-8M, β-磷酸甘油1.5mg/ml,抗坏血酸50μg/ml)，以后每3～4d换一次液；6 j2 d( q& F( `$ G
(3)2w后进行茜素S染色鉴定。; y& A5 R! D8 _6 ^9 p
3.2.3 MSC向脂肪细胞的诱导分化
' A3 R! c8 J3 U3 F4 l1 {: F0 ?(1)取P2代MSC在传代的同时以2×104/cm2的密度接种于24孔板中，每孔加入15%FBS，1ng/ml bFGF的低糖DMEM培养液0.8ml；
  S- c+ a" S' m7 o" u(2)待细胞达80%融合，换为诱导培养液(高糖DMEM, FBS 15%, 胰岛素 10ng/ul)，以后每3～4d换一次液；
+ L$ C1 B& f2 `  z! h$ K2 E(3)2w后进行苏丹Ⅳ染色鉴定。
, o& ^! \9 {0 JMSC的成骨和成脂肪的检测8 @" r( ]: x4 T7 r
茜素S染色方法( O; Q/ V/ V" H& k4 W$ b+ F8 J# W* V
(1)吸去培养液，PBS洗2次，每次5min;2 y# C  Q5 C0 ^" O: r/ n
(2)90%乙醇固定15min，蒸馏水洗2次；: y/ {+ D0 {! k3 R5 c
(3)茜素S染色8min，蒸馏水洗2次,70%、95%及100%的乙醇分别固定5min,甘油封片。8 Q0 L* W5 ?* R) W
苏丹Ⅳ染色方法* z+ Z2 ]# j4 O5 G+ |
(1)吸去培养液后用PBS洗2次，每次5min；7 S5 D8 _" z9 e* l( R
(2)10%甲醛固定15min，蒸馏水洗2次；$ G; U* K- U' T
(3)苏丹Ⅳ染色8min，蒸馏水洗2次,苏木精染色10min，自来水洗。甘油封片。

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成软骨细胞的诱导- {7 ~- m: r8 D) G. L* X
选前 三 代 生长良好的MSCs，消化后制成单细胞悬液，以3X 1 0"/ml的密度接
/ t6 ~( b0 U% L1 h+ N& x4 w种于 细胞瓶中，待细胞达到80-90%融合后，每隔三天换液一次，倒置显微镜下观察 。14 天后 终止诱导。提取总RNA，设计II型前胶元的引物序列，COL(I I) 上游:5 ' -TTC AGC TAT GGA GAT GAC AAT C-3‘，下游:5’-AGA GTC CTA GAG TGA CTGAG-3 ，产物片断4756p，进行RT-PCR扩增。其产物经琼脂糖凝胶电泳后观察，检测II型前胶元mRNA的表达。
5 P7 U3 N" N0 h; i) m软骨细胞诱导液:
( I+ o6 z% r# s( p- t# d7 nDEM E 高糖 培养液，10%胎牛血清，100u/ml青霉素，l00g/ml链霉素，TGF1 @  @3 v1 A8 J
-P }10ng/ml，抗坏血酸50ug/mla

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体外诱导MSCs向神经细胞分化) P8 ^& V; u; `' N* p* }
体外诱导MSCs向神经细胞分化. e! }3 H, `2 \  h
取体 外扩增至第2代的MScs，以lx105/ml浓度接种于放置有消毒盖玻片
: `) J+ o6 X! |的6孔板内，制备细胞爬片。lw后进行诱导:加10ng/1lllEGF+含10%FBs) M" g/ x0 k! r5 c$ j
的培养液预诱导3d，加lm oFLBME+含10%FBS的培养液预诱导ld，24h
9 o9 ?8 B. J( \4 W2 }) b5 e后加1林mo比声JRA+含10%FBs的培养液进行诱导。诱导24h后密切观察，可见多数细胞形成明显的神经元样细胞形态，胞体呈圆形，突起较长，双极或多极形，在突起末端出现分支，部分相邻细胞的突起连接成网。

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选择合适的代数（P3-5代）进行多向诱导分化
! e6 p. |& a7 A成骨诱导培养液的配置：含10%FBS的α-MEM培养液中添加50 μM 抗坏血酸, 10mmβ-磷酸甘油 和 100nm 地塞米松；取P4细胞，按照5×103个/cm2接种6孔板，在生长培养液（α-MEM培养液）中长到基本融合时，更换成成骨诱导培养液，每3d换液，于 7d时进行碱性磷酸酶染色，28d时进行矿化结节的茜素红染色。
! l) K* v8 l; @: Y6 R& ?/ F茜素红染色：吸去培养液，PBS冲洗两遍；10%甲醛实温固定15min； ddH2O冲洗两遍； 加入1ml/孔的40mM的茜素红染色液，室温孵育 20min并轻微振荡；吸取未结合的燃料，用ddH2O漂洗并振荡5min重复4次；倾斜放置2min,吸取多余的ddH2O；倒置显微镜观察拍照记录。
$ p0 Z. I; ^& o3 t  T/ U
8 j/ L4 d+ ]5 o4 [/ g3 {$ A成脂诱导培养液的配置：含10%FBS的HG-DMEM培养液中添加1μM地塞米松,10μg/ml胰岛素，200μM吲哚美辛和0.5mM IBMX；取P4细胞，按照2×104个/cm2接种6孔板，在生长培养液（HG-DMEM培养液）中长到基本融合时，更换成脂诱导培养液诱导2d,再用只含有10μg/ml胰岛素的成脂维持液培养1d，如此循环培养至14天，进行油红O染色。
2 \! z0 B, C8 F& `: N+ L4 R油红O染色：吸去培养液，PBS冲洗两遍；27.5%甲醛室温固定20min；ddH2O冲洗三遍，空气干燥；加入0.5%的油红O,室温孵育1h；70%乙醇洗涤3次；倒置显微镜观察拍照记录。

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肝样细胞诱导分化[1~3]
& Y" r* q" C6 X2 W6 I. H2 GDMEM中补充bFGF\HGF分别至20ng/ml和10ng/ml，3天换液一次，重新补充因子，在7天左右可以检测得到肝特异基因，蛋白AFP，ALB等的表达
9 I* F6 Q9 s, [& P
1 k; r4 j0 ^! m. u/ ^7 u1.Shin-Yeu Onga, Hui Daia, Kam W. Leonga,b, Inducing hepatic differentiation of human mesenchymal stem cells in pellet culture. Biomaterials. 2006, 4087–4097) x0 h% }/ d3 ~9 x6 Y
2. Taléns-Visconti a, A. Bonora a, R. Jover a, V. Mirabet b, F. Carbonell b.
& [3 t: e$ L6 f$ uHuman mesenchymal stem cells from adipose tissue: DiVerentiation
: }/ a8 u1 A4 Finto hepatic lineage .oxicology in Vitro 21 (2007) 324–329
0 l" |& y% C  h; h, t3.Qing-Jun Zhoua, Yan-Dan Huanga,1, Li-Xin Xiang. In vitro differentiation of embryonic stem cells into hepatocytes induced by fibroblast growth factors. the International Journal of Biochemistry & Cell Biology ,2007,1714–1721

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2.rMSCs成骨和脂肪细胞诱导分化
4 ~. k1 z+ W% L# y; N" s2.1体外定向诱导rMSCs分化为成骨细胞8 z  s+ @1 b+ I- f& Z& a' W! g
以接种密度为4×103/cm2将P3代rMSCs接种于预先置有盖玻片的6孔板内以制备细胞爬片。待细胞融合达80%,吸去孔内培养液,实验组每孔加入成骨条件培养基2mL置培养箱中,隔天换液1次，共诱导3周。对照组加入含10%胎牛血清(FCS)的L-DMEM培养液。3周末应用茜素红S染色法检测钙沉积。
5 S8 U2 V' \# K; F+ ]" A1 }茜素红S染色法步骤：
% y8 \# S. g$ [! ?) |/ D(1)诱导第21天,吸去成骨条件培养基,PBS洗涤3次! _2 L4 w9 n, b" T% A
(2)茜素红染2min。3 x) l0 k% K# w* W# P
(3)蒸馏水洗5-10s。, i* c) K; b3 g6 a
(4)分化液洗15s。7 }5 Y+ [# _- d* x# i; t
(5)PBS洗涤3次，显微镜下观察并拍照。
; F4 m3 |  b5 z" J6 I3 I5 m( e2.2体外定向诱导rMSCs分化为脂肪细胞
6 o* ^3 n' C/ }1 a以4 ×103/cm2将P3代rMSCs密度接种于预先置有盖玻片的6孔板内以制备细胞爬片。细胞达到80％融合后,加入成脂条件培养基2 mL置培养箱中,隔天换液1次，共诱导3周。对照组加入含10%胎牛血清(FCS)的L-DMEM培养液。3周末应用油红O染色法检测脂滴形成
* I4 m: m% k7 C- K- p$ W- j油红O染色法步骤：9 o3 e; g# b, q% D$ A: g
(1)细胞爬片用PBS清洗两次，每次5min;
4 A" C" O. H' q3 D" W2 K$ b(2)4%多聚甲醛固定15 min;
5 U/ u4 T# i/ |" [" a(3)PBS漂洗两次，每次5min;
  ]- i6 H- B- P(4)入60%异丙醇漂洗。% f# a' k- B$ B, F4 ?
(5)入油红O染色15分钟。/ [. T: l! g4 z1 @1 C
Devil60%异丙醇漂洗。
( Q) q) M- D2 F8 @& s$ e# S! @) t% e& l. |  w5 g
3.rMSCs成肌细胞诱导分化
7 b& t+ t& s+ e& N) f/ G以4 ×103/cm2将P3代rMSCs密度接种于预先置有盖玻片的6孔板内以制备细胞爬片。细胞达到80％融合后,加入含五氮杂胞苷（10umol/L，用 PBS配制）的DMEM2 mL置培养箱培养24小时,然后换用含有2%马血清的DMEM培养基培养7——10天。对照组换用PBS诱导24小时后，加入含2%马血清的L-DMEM 培养液。鉴定：可用MHC,MYOD,MYOGENIN,MHC等肌性标记物行免疫荧光染色。1 q1 R( m0 _2 p- `8 B
参考文献：1.Wakitani, S., T. Saito, and A.I. Caplan, Myogenic cells derived from rat bone marrow mesenchymal stem cells exposed to 5-azacytidine. Muscle Nerve, 1995. 18(12): p. 1417-26.

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新西兰大白兔的肌源性干细胞MDSC诱导分化平滑肌细胞SMC4 {( m3 l' }4 W
一、利用差速贴壁法分离兔MDSC及鉴定：2 H2 B, G/ i8 W, G0 _
1、根据Qu～1方法改进：麻醉1.5个月龄2.0kg新西兰兔，无菌切取10g大腿肌肉，剪成肉泥并置入15ml无菌离心管中。
* B$ u) ?. k% A+ U0 Y2、分别用0.2％的ⅩⅠ型胶原酶消化1h、dispase消化45min以及0.1%trypsin消化30min。
7 l* S' _2 s+ `) o) K3、消化均在37℃恒温培养箱内进行，每次消化指间需离心并取沉淀进行下一步消化。8 U+ J' y' L" B6 x4 J: I4 d
4、消化后的沉淀用增殖培养基重悬，并接种在用胶原（0.1％鼠尾胶溶液，自制）包被的培养瓶中，该瓶称为PP1。
. ?; r. [* q# y) f5、PP1于37℃、5％CO2的细胞培养箱中静置过夜，随后将悬液转移到另一个胶原包被的培养瓶中培养，称为PP2。
& V- g9 v0 U# }- R" Y6、此后连续4d每隔24h将悬液离心、重悬后转移至新的培养瓶中，分别为PP3-PP6。
' d9 i  J( r' c& L; U* J7、PP1-PP5弃去不用，PP6用于进一步诱导分化实验，细胞在达到约30％汇合时必须传代，继续接种至胶原预包被的新培养瓶内加入增殖培养基进行培养。' ?" k! h( [$ [9 D. W% C5 G
8、PP6在汇合度达到30%前进行细胞表型鉴定，分别采用FCM检测desmin、CD45、bcl-2的阳性细胞数百分率。
- m" {7 \* p. C- T7 k+ {9、采用免疫细胞化学检测desmin的表达情况。( y. l! m! `0 x% R, g
二、诱导分化实验：
, x2 t4 N$ _7 \' Q' b) q取PP6进行诱导，采用两种方法：
8 }5 F) [0 g: A) W$ h! @8 Y9 X# g+ u  i% a; _. p* i8 c- Y
1、共培养诱导：
' J# f+ G  r/ L8 c细胞消化后离心去上清，用浓度为5mg/L的Hoechst33342（用增殖培养基配制）重悬，避光并在细胞培养箱内孵育20min，随后离心去上清，用增殖培养基重悬，调整密度至1x10~3个/ml，接种到6孔板，每个孔内加入等量的兔阴茎海绵体平滑肌细胞CCSMC进行共培养，2d后进行免疫组化检测α－SMA表达情况。) _, ^) u" h7 d4 W( n2 c
另设一组对称的未处理组，即PP6单独培养组，以及CCSMC组作为阳性对照，进行激光共聚焦显微镜观察及拍照。
$ z" r- M/ [8 X2、直接诱导：
: @5 C* b5 O6 s+ t9 o细胞消化下来后接种到6孔板，并且添加VEGF，使其在每孔的终浓度为25ug/L，置入培养箱，2d后进行免疫细胞化学以及Western blot法检测α－SMA表达情况（选用GAPDH作为内参）。! c3 a5 ]1 f/ C) @) [: N: a
同时另设一对称的未处理组，即未添加VEGF的PP6单独培养，并设立成纤维细胞组作为阴性对照，以及CCSMC组作为阳性对照。
( b2 N4 G1 |' B- K, \8 @5 |' n2 J" W- ?8 H; ^5 W
增殖培养基：20％的胎牛血清、20％马血清、80％DMED-LG: [0 ?9 y( G3 V- z; [  t
9 Q* p2 I/ c" Z+ c

. M( Q+ }  I8 j8 \Qu Z,Balkir L,Van Deutekom JC,et al. Development of approaches to improve cell survival in myoblast transfer therapy.J Cell Biol.1998,142:1257-1267

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CD34+CD38-的干细胞向 粒系的诱导分化:
+ k$ A! {# ^# i细胞培养体系为lml,200微升的胎牛血清,800微升的IMEM,SCF 10ng, IL-3 5ng,
, w1 m4 q# M( ]2 r0 vGM-CSF 5ng, G-CSF 5000U,前面三个因子是peprotech公司的,后一细胞因子就是临床的瑞白.在诱导的第七天可见所有的细胞都表达CD33,在诱导的14天可见90%的细胞CD15明显表达!

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脐血造血干细胞诱导分化为巨核细胞
3 `" K7 J3 R: nx123u：脐血造血干细胞诱导分化为巨核细胞
/ }  V0 u& Y% y0 A/ ?% O# m' F2 ~/ e3 T$ A' q1 [
1．用含肝素抗凝的无菌干燥瓶收集，采血量为80-100 ml。5 G0 v% A# X0 F3 G; `9 j

) t& }2 ]. G7 K" @) X: x! B. W, v  O2．细胞因子：TPO、FLT3-L 、IL-3、IL-6和SCF。
2 U9 R9 t3 i; P( I  l; W, P" j
/ O6 O; M7 y, C9 c* l3．应用免疫磁珠MACS方法分离脐血CD34＋细胞，然后取部分细胞进行流式细胞仪测定、鉴定和分离纯度。3 n. Q% k4 }9 a4 q9 s/ K
) a2 l* Q: v& K' N3 [
4．诱导方案：CD41＋细胞的体外诱导扩增用含10％ FCS和5×10 mol/L二巯基乙醇的IMDM，将CD34＋细胞浓度调整为2×10/ml，加入24孔板，每孔终体积为1mL。细胞因子组合为：TPO+SCF+ IL3+IL6，细胞因子的终浓度为：IL3 10 ng/ml，IL-6 10 ng/ml，SCF 50 ng/ml，TPO 10 ng/ml，FLT-3L 10 ng/ml。将上述扩增体系置37度饱和湿度CO2培养箱中培养，每3天半量换液1次，添加全量的造血生长因子，培养3周，在培养的第7天或14天测定培养体系的总细胞数，用流式细胞仪测定 CD41＋细胞的含量即为巨核细胞。% C" K  t8 V, [8 s" s
; T) {( y1 b$ ]8 W& P0 Z. j/ y8 h3 g
5．甲基纤维素半固体培养法培养对CD41＋细胞进行集落培养以进一步鉴定。' Y+ z3 y& J4 v0 |
( A% s) W# Q( m9 w: J3 M
参考文献：9 \* O- U! R" V/ x9 Z' _
1.Williams JL．Pipia GG ，Datta NS，et al. Thrombopoietin rquires additional mgakaryocyte-active cytokines for optimal，ex vivo expansion of megakaryocyte precursor cyells．Blood，1998；91：4118-4l26.  K5 I- E" a$ s" C( a1 B
2.Li K．Yan g M，Lam AC，et al. Efects offit3 ligan d in combination with TPO on the expan sion of megakaryocytic progenitors．Cell Transplant，2000；9：125-131.

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zeronepl! E5 O  M8 ^9 o% p% |, u8 c( l( r6 P
1.1 BMSCs向成骨细胞诱导分化
# J' B7 t0 \; K: e  W5 q0 N. A* \; a+ U诱导剂主要有10-8mol/L地塞米松、50μg/ml抗坏血酸、10mmol/L β-甘油磷酸钠、FBS和DMEM-LG液。
' o4 o) ^8 d( F6 X  s. v1.2 BMSCs向软骨细胞诱导分化
% _; K7 v! a* R3 z7 _诱导剂主要有胰岛素、转铁蛋白、牛血清白蛋白、丙酮酸钠、亚油酸、维生素C、地塞米松、TGF-β。
* k, f6 E- Q: f3 q1 t# z5 a' C1.3 BMSCs向脂肪细胞诱导分化
9 z) D) N) v/ N6 k* M9 t诱导剂主要有1-甲基-3-异丁基黄嘌呤、胰岛素、地塞米松和消炎痛等。6 i4 K4 A3 Q7 y
1.4 BMSCs向神经细胞诱导分化
# m/ U3 c8 v4 \诱导剂主要有β-巯基乙醇、二甲基亚砜、丁化羟基苯甲醚。
* H- t( m* K8 k3 s+ Z1.5 BMSCs向内皮细胞诱导分化4 u" f& @/ D' k# {# M
诱导剂主要有胰岛素、转铁蛋白、硒、牛血清白蛋白、地塞米松、2-磷酸抗坏血酸及微量VEGF等。, O$ R; _) u# i2 U' W" j3 j' T6 Q0 x
1.6 BMSCs向肝细胞诱导分化
; Y( ^5 e# K! C& p" d$ k. o$ x- w1.7 BMSCs向心肌细胞诱导分化7 B$ @! O4 b2 J% O  ?
诱导剂主要有5-氮胞苷。
& H. h1 ~$ k# i" n- V3 |1.8 BMSCs向胰岛细胞诱导分化
! F8 C9 r- o$ J. L5 p9 [诱导剂主要有β-巯基乙醇、尼克酰胺、B27。