MSC诱导分化专题

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样本:
: w6 o" c; J( F7 X# MMSC向成骨细胞的诱导分化
" ^3 d( y; `  s9 V" j(1)取P2代MSC在传代的同时以2×104/cm2的密度接种于24孔板中，每孔加入15%FBS，1ng/ml bFGF的低糖DMEM培养液0.8ml；9 N  ~- f: u9 x) G! K  }
(2)待细胞达80%融合，换为诱导培养液(高糖DMEM, 地塞米松 10-8M, β-磷酸甘油1.5mg/ml,抗坏血酸50μg/ml)，以后每3～4d换一次液；% A! ~6 V9 H0 e8 g" A- E  q
(3)2w后进行茜素S染色鉴定。
* m8 V& z6 O- K; q" b0 \: [3.2.3 MSC向脂肪细胞的诱导分化! O" f5 U3 r7 X( g* H' i
(1)取P2代MSC在传代的同时以2×104/cm2的密度接种于24孔板中，每孔加入15%FBS，1ng/ml bFGF的低糖DMEM培养液0.8ml；7 e! I5 p2 ?% K2 ]: C+ G
(2)待细胞达80%融合，换为诱导培养液(高糖DMEM, FBS 15%, 胰岛素 10ng/ul)，以后每3～4d换一次液；) G" T! F( r6 |3 P' _0 }7 p$ ^1 @
(3)2w后进行苏丹Ⅳ染色鉴定。
( L$ y0 E, y: E' n6 l' ZMSC的成骨和成脂肪的检测7 |; d9 {: u. G7 u4 _/ _# e
茜素S染色方法
; L7 v$ W, h9 q3 l3 ?(1)吸去培养液，PBS洗2次，每次5min;, P, W' Z2 z# l5 @" s' d' v
(2)90%乙醇固定15min，蒸馏水洗2次；% c% T* o% n- D& O  \4 u
(3)茜素S染色8min，蒸馏水洗2次,70%、95%及100%的乙醇分别固定5min,甘油封片。
% z% _" H2 C8 p* _2 I5 `$ ~苏丹Ⅳ染色方法
0 r" E2 R% k' _, E; o2 e(1)吸去培养液后用PBS洗2次，每次5min；
8 Y5 @& i3 a! Y5 S6 v(2)10%甲醛固定15min，蒸馏水洗2次；
, C- [0 b3 U9 G" I! r  Y, l(3)苏丹Ⅳ染色8min，蒸馏水洗2次,苏木精染色10min，自来水洗。甘油封片。

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成软骨细胞的诱导! F! {& g. j9 J4 n
选前 三 代 生长良好的MSCs，消化后制成单细胞悬液，以3X 1 0"/ml的密度接* l; c/ T* \3 y( N
种于 细胞瓶中，待细胞达到80-90%融合后，每隔三天换液一次，倒置显微镜下观察 。14 天后 终止诱导。提取总RNA，设计II型前胶元的引物序列，COL(I I) 上游:5 ' -TTC AGC TAT GGA GAT GAC AAT C-3‘，下游:5’-AGA GTC CTA GAG TGA CTGAG-3 ，产物片断4756p，进行RT-PCR扩增。其产物经琼脂糖凝胶电泳后观察，检测II型前胶元mRNA的表达。
' x; s9 r  t4 u7 e8 |# d% t软骨细胞诱导液:
5 E. t8 h- C( t7 i7 G! iDEM E 高糖 培养液，10%胎牛血清，100u/ml青霉素，l00g/ml链霉素，TGF
% F- |) a) i8 O3 e-P }10ng/ml，抗坏血酸50ug/mla

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体外诱导MSCs向神经细胞分化
, o- d5 y" f8 k1 e6 y' l体外诱导MSCs向神经细胞分化
7 ~. L# |* D# d3 K2 ]. ~取体 外扩增至第2代的MScs，以lx105/ml浓度接种于放置有消毒盖玻片# y' Q- k- f3 S( {# u5 G
的6孔板内，制备细胞爬片。lw后进行诱导:加10ng/1lllEGF+含10%FBs
% E6 @7 M9 q# B的培养液预诱导3d，加lm oFLBME+含10%FBS的培养液预诱导ld，24h
; Z! p4 ?7 T. A, g  M- B后加1林mo比声JRA+含10%FBs的培养液进行诱导。诱导24h后密切观察，可见多数细胞形成明显的神经元样细胞形态，胞体呈圆形，突起较长，双极或多极形，在突起末端出现分支，部分相邻细胞的突起连接成网。

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选择合适的代数（P3-5代）进行多向诱导分化
+ P" \5 `" x" Q( J- P7 N成骨诱导培养液的配置：含10%FBS的α-MEM培养液中添加50 μM 抗坏血酸, 10mmβ-磷酸甘油 和 100nm 地塞米松；取P4细胞，按照5×103个/cm2接种6孔板，在生长培养液（α-MEM培养液）中长到基本融合时，更换成成骨诱导培养液，每3d换液，于 7d时进行碱性磷酸酶染色，28d时进行矿化结节的茜素红染色。
0 D$ ]1 j3 \: Z0 U3 @+ r; q茜素红染色：吸去培养液，PBS冲洗两遍；10%甲醛实温固定15min； ddH2O冲洗两遍； 加入1ml/孔的40mM的茜素红染色液，室温孵育 20min并轻微振荡；吸取未结合的燃料，用ddH2O漂洗并振荡5min重复4次；倾斜放置2min,吸取多余的ddH2O；倒置显微镜观察拍照记录。+ L& n2 W# I2 c8 @) r
/ T2 t! I4 w) |; t1 c- {5 `
成脂诱导培养液的配置：含10%FBS的HG-DMEM培养液中添加1μM地塞米松,10μg/ml胰岛素，200μM吲哚美辛和0.5mM IBMX；取P4细胞，按照2×104个/cm2接种6孔板，在生长培养液（HG-DMEM培养液）中长到基本融合时，更换成脂诱导培养液诱导2d,再用只含有10μg/ml胰岛素的成脂维持液培养1d，如此循环培养至14天，进行油红O染色。
# n8 D0 m9 f: M; r5 O$ X2 \油红O染色：吸去培养液，PBS冲洗两遍；27.5%甲醛室温固定20min；ddH2O冲洗三遍，空气干燥；加入0.5%的油红O,室温孵育1h；70%乙醇洗涤3次；倒置显微镜观察拍照记录。

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肝样细胞诱导分化[1~3]
) b1 s2 ?% ]# U/ j" s9 W4 Y6 wDMEM中补充bFGF\HGF分别至20ng/ml和10ng/ml，3天换液一次，重新补充因子，在7天左右可以检测得到肝特异基因，蛋白AFP，ALB等的表达
8 p4 ^7 S, h; h' n' K
: H0 U& v: _& g# [% D1.Shin-Yeu Onga, Hui Daia, Kam W. Leonga,b, Inducing hepatic differentiation of human mesenchymal stem cells in pellet culture. Biomaterials. 2006, 4087–4097
( j5 v3 j. v2 M. h, L- Y! w  P2. Taléns-Visconti a, A. Bonora a, R. Jover a, V. Mirabet b, F. Carbonell b.
- Y# r8 k6 D. a, S. A4 h; xHuman mesenchymal stem cells from adipose tissue: DiVerentiation) Q# i% I5 p; Q4 x
into hepatic lineage .oxicology in Vitro 21 (2007) 324–329
3 _9 O+ m1 U, {1 c0 x7 S3.Qing-Jun Zhoua, Yan-Dan Huanga,1, Li-Xin Xiang. In vitro differentiation of embryonic stem cells into hepatocytes induced by fibroblast growth factors. the International Journal of Biochemistry & Cell Biology ,2007,1714–1721

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2.rMSCs成骨和脂肪细胞诱导分化
$ ?: A7 c9 W; [% c' ?2.1体外定向诱导rMSCs分化为成骨细胞
, x; `( ?0 _4 K6 R/ R以接种密度为4×103/cm2将P3代rMSCs接种于预先置有盖玻片的6孔板内以制备细胞爬片。待细胞融合达80%,吸去孔内培养液,实验组每孔加入成骨条件培养基2mL置培养箱中,隔天换液1次，共诱导3周。对照组加入含10%胎牛血清(FCS)的L-DMEM培养液。3周末应用茜素红S染色法检测钙沉积。
' t- D  Z  R( i茜素红S染色法步骤：
, x  I$ X2 ?0 L2 }(1)诱导第21天,吸去成骨条件培养基,PBS洗涤3次- x: E, c5 z5 A/ f4 x' D. t4 ^, H( m
(2)茜素红染2min。
1 U- y, z  d  C(3)蒸馏水洗5-10s。7 |; L1 u0 @+ ?
(4)分化液洗15s。$ \, U5 Z$ H8 f
(5)PBS洗涤3次，显微镜下观察并拍照。
. Q. D% w% T; d0 Q2.2体外定向诱导rMSCs分化为脂肪细胞6 d! ~% d; M, j+ I5 Q3 p% E1 x
以4 ×103/cm2将P3代rMSCs密度接种于预先置有盖玻片的6孔板内以制备细胞爬片。细胞达到80％融合后,加入成脂条件培养基2 mL置培养箱中,隔天换液1次，共诱导3周。对照组加入含10%胎牛血清(FCS)的L-DMEM培养液。3周末应用油红O染色法检测脂滴形成6 P/ R* s- x" M
油红O染色法步骤：
& ?5 k4 w8 a9 X/ B) N( z(1)细胞爬片用PBS清洗两次，每次5min;) x) k6 ?( b, ]; o. v, U$ S$ m( H
(2)4%多聚甲醛固定15 min;
8 {& J7 ]2 ?0 {(3)PBS漂洗两次，每次5min;+ j. E( z/ r& W8 w' |* W
(4)入60%异丙醇漂洗。
$ x8 i" q7 f/ N7 R0 P4 N(5)入油红O染色15分钟。0 z- O3 c; W. m% X' \$ e3 R1 U
Devil60%异丙醇漂洗。
6 T1 W4 P* S% F7 J  M1 d! v1 D. t  X6 ]
3.rMSCs成肌细胞诱导分化
3 }% U  {3 Q% V: |以4 ×103/cm2将P3代rMSCs密度接种于预先置有盖玻片的6孔板内以制备细胞爬片。细胞达到80％融合后,加入含五氮杂胞苷（10umol/L，用 PBS配制）的DMEM2 mL置培养箱培养24小时,然后换用含有2%马血清的DMEM培养基培养7——10天。对照组换用PBS诱导24小时后，加入含2%马血清的L-DMEM 培养液。鉴定：可用MHC,MYOD,MYOGENIN,MHC等肌性标记物行免疫荧光染色。8 a( }9 {2 D1 P& m, `; ^
参考文献：1.Wakitani, S., T. Saito, and A.I. Caplan, Myogenic cells derived from rat bone marrow mesenchymal stem cells exposed to 5-azacytidine. Muscle Nerve, 1995. 18(12): p. 1417-26.

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新西兰大白兔的肌源性干细胞MDSC诱导分化平滑肌细胞SMC4 Q3 g, i; E+ r/ T
一、利用差速贴壁法分离兔MDSC及鉴定：
$ l/ g5 |* Q5 S" M# J3 G) H; O1、根据Qu～1方法改进：麻醉1.5个月龄2.0kg新西兰兔，无菌切取10g大腿肌肉，剪成肉泥并置入15ml无菌离心管中。7 i  M* c/ g; t1 ?! y! ~) [9 e
2、分别用0.2％的ⅩⅠ型胶原酶消化1h、dispase消化45min以及0.1%trypsin消化30min。" o0 k' o, m0 ~- G( n
3、消化均在37℃恒温培养箱内进行，每次消化指间需离心并取沉淀进行下一步消化。
- o( B9 G7 B0 m9 C4、消化后的沉淀用增殖培养基重悬，并接种在用胶原（0.1％鼠尾胶溶液，自制）包被的培养瓶中，该瓶称为PP1。+ q8 r- o( Y% n& a: w5 {
5、PP1于37℃、5％CO2的细胞培养箱中静置过夜，随后将悬液转移到另一个胶原包被的培养瓶中培养，称为PP2。
# M2 J" b9 o+ f  x6、此后连续4d每隔24h将悬液离心、重悬后转移至新的培养瓶中，分别为PP3-PP6。) ~: i0 E( {' |% u1 _8 B
7、PP1-PP5弃去不用，PP6用于进一步诱导分化实验，细胞在达到约30％汇合时必须传代，继续接种至胶原预包被的新培养瓶内加入增殖培养基进行培养。
: W! R9 Q0 y$ h6 c( X% }! O# u8、PP6在汇合度达到30%前进行细胞表型鉴定，分别采用FCM检测desmin、CD45、bcl-2的阳性细胞数百分率。
# X% U5 ]  I+ n3 C" i9、采用免疫细胞化学检测desmin的表达情况。7 i$ w! w" J8 B
二、诱导分化实验：
1 D. g9 ]8 z/ v' |取PP6进行诱导，采用两种方法：$ W8 n( ]2 S9 e- z' g) G* u: r

. c6 Q/ Z2 R$ G4 b+ M' L1 _1、共培养诱导：; v* z2 Y* C" o. ]8 p4 k" v+ C9 b
细胞消化后离心去上清，用浓度为5mg/L的Hoechst33342（用增殖培养基配制）重悬，避光并在细胞培养箱内孵育20min，随后离心去上清，用增殖培养基重悬，调整密度至1x10~3个/ml，接种到6孔板，每个孔内加入等量的兔阴茎海绵体平滑肌细胞CCSMC进行共培养，2d后进行免疫组化检测α－SMA表达情况。% I8 f' c' n4 p/ M% b. z$ r
另设一组对称的未处理组，即PP6单独培养组，以及CCSMC组作为阳性对照，进行激光共聚焦显微镜观察及拍照。
3 z0 ~; ^6 O- \: k# J6 D, _2、直接诱导：" {+ Y. T3 j7 @; f% A& P/ R
细胞消化下来后接种到6孔板，并且添加VEGF，使其在每孔的终浓度为25ug/L，置入培养箱，2d后进行免疫细胞化学以及Western blot法检测α－SMA表达情况（选用GAPDH作为内参）。; @  M8 C3 B# p) X
同时另设一对称的未处理组，即未添加VEGF的PP6单独培养，并设立成纤维细胞组作为阴性对照，以及CCSMC组作为阳性对照。, ~7 \+ h2 f1 w$ L  l8 V8 @' H

1 P" V8 n/ s5 Y& }4 {增殖培养基：20％的胎牛血清、20％马血清、80％DMED-LG0 a' @8 M$ O6 i; S  @. y- m" d, g

( a" a+ S# ~  }% n: [, O& @/ q- c$ B/ V9 p/ v" W, _: U
Qu Z,Balkir L,Van Deutekom JC,et al. Development of approaches to improve cell survival in myoblast transfer therapy.J Cell Biol.1998,142:1257-1267

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CD34+CD38-的干细胞向 粒系的诱导分化:
% H2 z" a8 d6 \5 ]9 H" @$ m2 |. n3 M细胞培养体系为lml,200微升的胎牛血清,800微升的IMEM,SCF 10ng, IL-3 5ng,
  u2 v+ N2 q% N3 M9 zGM-CSF 5ng, G-CSF 5000U,前面三个因子是peprotech公司的,后一细胞因子就是临床的瑞白.在诱导的第七天可见所有的细胞都表达CD33,在诱导的14天可见90%的细胞CD15明显表达!

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脐血造血干细胞诱导分化为巨核细胞8 I. p! \+ L3 @0 U' m
x123u：脐血造血干细胞诱导分化为巨核细胞
& M6 }/ b: z6 h# H0 l2 l+ n3 c- l) \/ @# D
1．用含肝素抗凝的无菌干燥瓶收集，采血量为80-100 ml。  o- g- b' Y7 o6 g; y* M
9 J. e* X9 |% t8 B  I+ N
2．细胞因子：TPO、FLT3-L 、IL-3、IL-6和SCF。
' `$ q* j5 D$ o( Q) |3 V5 ~
, c8 c4 h9 h  w( S, _. H3 S3．应用免疫磁珠MACS方法分离脐血CD34＋细胞，然后取部分细胞进行流式细胞仪测定、鉴定和分离纯度。
7 n0 W7 _3 K. {
" j! h0 R7 [7 v3 K! ]4．诱导方案：CD41＋细胞的体外诱导扩增用含10％ FCS和5×10 mol/L二巯基乙醇的IMDM，将CD34＋细胞浓度调整为2×10/ml，加入24孔板，每孔终体积为1mL。细胞因子组合为：TPO+SCF+ IL3+IL6，细胞因子的终浓度为：IL3 10 ng/ml，IL-6 10 ng/ml，SCF 50 ng/ml，TPO 10 ng/ml，FLT-3L 10 ng/ml。将上述扩增体系置37度饱和湿度CO2培养箱中培养，每3天半量换液1次，添加全量的造血生长因子，培养3周，在培养的第7天或14天测定培养体系的总细胞数，用流式细胞仪测定 CD41＋细胞的含量即为巨核细胞。
6 \3 {/ M+ n0 s' O1 H  w
( G9 g% |  ~! r9 F+ C! N9 [2 \9 C5．甲基纤维素半固体培养法培养对CD41＋细胞进行集落培养以进一步鉴定。
  a7 w. w- `9 U; J/ l! o% J
- D9 E2 R! t) v8 p) e; P参考文献：+ J% O1 G! Q- S
1.Williams JL．Pipia GG ，Datta NS，et al. Thrombopoietin rquires additional mgakaryocyte-active cytokines for optimal，ex vivo expansion of megakaryocyte precursor cyells．Blood，1998；91：4118-4l26.
& v$ e- P4 ~( V1 i. \3 G% M2.Li K．Yan g M，Lam AC，et al. Efects offit3 ligan d in combination with TPO on the expan sion of megakaryocytic progenitors．Cell Transplant，2000；9：125-131.

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zeronepl) U( A7 X% @* x
1.1 BMSCs向成骨细胞诱导分化
% b' v, \  H. T诱导剂主要有10-8mol/L地塞米松、50μg/ml抗坏血酸、10mmol/L β-甘油磷酸钠、FBS和DMEM-LG液。
. ]4 i% B6 Q( Q) V1.2 BMSCs向软骨细胞诱导分化
9 G- i$ O$ y1 X$ a诱导剂主要有胰岛素、转铁蛋白、牛血清白蛋白、丙酮酸钠、亚油酸、维生素C、地塞米松、TGF-β。8 r8 s% I2 I4 D
1.3 BMSCs向脂肪细胞诱导分化
% m6 R" k3 E) `4 q1 F( q2 z诱导剂主要有1-甲基-3-异丁基黄嘌呤、胰岛素、地塞米松和消炎痛等。
8 U$ a' ^* O8 _- P; w$ l' o1.4 BMSCs向神经细胞诱导分化
, n( H+ I/ F4 Z' _7 y诱导剂主要有β-巯基乙醇、二甲基亚砜、丁化羟基苯甲醚。
! B! e1 a: X; ^1.5 BMSCs向内皮细胞诱导分化! [7 ]1 h. A7 v9 H! [" R% u
诱导剂主要有胰岛素、转铁蛋白、硒、牛血清白蛋白、地塞米松、2-磷酸抗坏血酸及微量VEGF等。9 q  p, u2 ~' C
1.6 BMSCs向肝细胞诱导分化
! R- R3 _: v$ }1.7 BMSCs向心肌细胞诱导分化: R7 \9 e) e$ K- U4 t. i
诱导剂主要有5-氮胞苷。. Z' T; t2 J/ M: b: q
1.8 BMSCs向胰岛细胞诱导分化1 x' \( O7 Z7 @6 ^; r
诱导剂主要有β-巯基乙醇、尼克酰胺、B27。