脐带间充质干细胞的具体培养步骤

wojoo

转帖 看到的一个好贴子 原创ye_xiangyang& b! o2 U* G6 i7 G3 |) u
, o$ r7 A- T4 N" `) Q2 t
我说说吧，主要有组织块贴壁法、双酶消化法，两种方法中我建议要是不急的话选用前一种方法，因为，操作相对简单，只是时间要长点，一般要15-20天传第一代。不管用什么方法，脐带来源无菌十分重要，操作时也要注意不要污染。0 p! E, ?# y7 p2 x
组织块贴壁法：PBS反复冲洗脐带，特别是在脐静脉内的血液用注射器冲洗。在培养皿内顶住脐带，先用大剪刀剪成大碎块，再用眼科剪刀细细的剪成1x1mm大小的组织块，剪碎过程中不要加入PBS，这样容易点。剪碎以后均匀铺开组织块，间隔1cm即可，倒置培养皿，放入37°培养箱，一个到一个半小时取出，见组织块已经粘附在培养皿底部，延边源缓缓加入培养基，一定不要冲起组织块，要让培养基逐渐蔓延整个培养体系，再多加点，放入培养箱内，不要动，一周后上镜看，如果有细胞沿组织块边缘出现你就赢了，可以以后间隔3天换液了，等到组织块周围细胞呈集落生长，可以传代了。1 X+ x/ B4 `+ D$ T: W
浅见，我培养过。挺成熟的技术，望成功。

Learner

两篇文献关于脐带间充质干细胞的分离方法和大家分享一下！

Learner

回复 清影 的帖子
: |) w! b+ Y, s; i" Y
& [$ R) A6 V' U有文献说：脐带wharton Jelly中主要是透明质酸。

Learner

我前面两种方法都试过了，但是都不太成功。第一次，我用酶消化法因为样品取来较晚，用的是四型胶原酶过夜消化，第二天早上想离心发现消化后的样品太粘稠了，即使离心也有很多细胞在上清液中。我就直接将上清和下面的组织块分别种在培养皿中。三天后发现细胞大量死亡，我还以为是污染了，其实不是。我将它们全部换液，看见皿底有少量细胞贴壁，星星点点。换几次液后细胞都活下来了。但是很少，长的也不快，看来要很久才能长满。( f- u- ]) {( {0 g  T: R
第二次，我用了消化法和直接贴壁法两种。消化法没有过夜，按照一个文献中讲到用0.1%胶原酶消化一小时，再用0.25%胰酶消化半小时离心。这次有了上次的经验，我用体积远远大于消化液的PBS稀释后离心。种到培养皿中结果第二天细胞大部分都死了。是不是过度消化了？. i% X& N# q  w: V
直接贴壁法：我剔除血管后，将组织剪碎然后再将剪碎后的组织贴于培养皿底部，中间没有留出间隔。在超净台中放置15分钟使组织贴壁后缓慢加培养基。第二天观察组织周围有一些圆形未贴壁的细胞。三天后换液，还是不见贴壁细胞，那些圆形细胞很小也不知是死是活。看起来也不乐观。可能是我性急，总想看，即使不看，在细胞爬出来之前用不用换液？希望做成功的前辈不啬赐教！

taoqilh

回复 烂桃 的帖子
* f, x; k' h( J# I/ N9 u6 l( u  [! z$ _- O* i0 ~7 M8 @- Q! P
你好，能加你为好友吗，我也是做猪的脐带间充质干细胞的，能和你请教一些问题，分享的点文献吗，关于猪的脐带间充质的文章还是比较少，借鉴的东西也少，和你请教一下。我是新手，没有加你为好友的权限，能加我为好友吗，谢谢

taoqilh

回复 烂桃 的帖子
/ E0 ^) e) ?) }( S* z( q' p% X* V6 u+ f# @; X& I( C
我也是做猪的脐带间充质干细胞，我做的过程中只有三根管，没有出现四根的，在培养过程中遇到了和你一样的问题。我尝试了消化后的细胞培养，由于先贴壁的以杂细胞比较多，所以在三天后把培养瓶里的培养液转移到另一个瓶子里，转移后贴壁的细胞相对而言纯一点，传代后基本看不到什么杂细胞
7 ?4 k( L4 M# l9 [0 a2 |' |6 F

zhangyujunwei

回复 wojoo 的帖子1 p1 a8 O! I9 t$ B& e/ o$ I

/ A( Q' y) Q+ ?, j1 j2 b, C很好的办法

xuehu20

有见地

xuzhili

经典的做法

清影

请问2楼，透明质酸酶是什么作用啊，去除粘稠么？